导读:本文包含了头孢菌素酰化酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:头孢菌素,头孢,半衰期,稳定性,酵母,氨基,突变。
头孢菌素酰化酶论文文献综述
罗晖,汪月,刘婧冉,仝双明,常雁红[1]（2019）在《头孢菌素C酰化酶的固定化策略及其对酶学性质的影响》一文中研究指出头孢菌素C酰化酶可以催化生产重要的医药中间体7-氨基头孢烷酸(7-ACA),作为一种重要的工业用酶,一般采用固定化的形式进行催化。本研究采用酶分子改造与固定化工艺调整两种途径进行酶的固定化研究,并考察了所获得固定化酶的相关性质。研究表明,酶分子表面的赖氨酸残基数量及分布情况会影响到酶在载体上的(本文来源于《第十二届中国酶工程学术研讨会论文摘要集》期刊2019-08-08）
刘新花[2]（2017）在《筛选B因子分析改造的头孢菌素C酰化酶突变体》一文中研究指出目前,半合成头孢菌素类在抗生素市场占据着重要地位,7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是生产半合成头孢菌素类抗生素的关键中间体,一步酶法可以通过头孢菌素C酰化酶直接酰化头孢菌素C(CPC)获得7-ACA。但CPC酰化酶在应用中仍存在对热敏感、稳定性不佳等问题,提高其热稳定性以进一步推动其工业应用。本论文以酰化酶蛋白晶体结构的B因子的数值作为筛查突变热点的准则,确定可能影响CPC酰化酶热稳定性的关键氨基酸残基,利用蛋白质工程手段改造CPC酰化酶分子,期望得到热稳定性提高的酰化酶突变体。本研究人工合成了叁段不同菌株来源的头孢菌素C(CPC)酰化酶,构建应用于大肠杆菌表达系统的重组质粒和菌株,发现其中仅Pseudomonas sp.SE.83 acyII S12 对CPC活性最高。Pseudomonas sp.SE83 acyII S12 基因编码 83kDa 的多肽前体,其前体经自剪切可得到25 kDa α亚基和58 kDa β亚基组成的成熟蛋白。以Pseudomonas sp.SE83 acyＩＩ S12为研究对象主要进行了以下研究:1.从PDB数据库中搜索cephalosporin acylase获得19个晶体数据,结合序列相似性及分析B因子值时对晶体分辨率有一定的要求等指标,最终选择PDB号为4HSR的晶体结构和数据作为本实验中分析SE83 acyＩＩ S12突变位点选择的模板参照。利用discovery studio软件计算得出4HSR蛋白质中氨基酸残基位点B因子数值及其氨基酸的类型并排序,比对4HSR与SE83 acyＩＩ S12多肽链的氨基酸残基α、β序列,在SE83 acyＩＩ S12多肽链中,选择与4HSR中较高B因子值对应的氨基酸残基作为潜在的突变热点。2.针对 Arg218,Lys226,Glu113,Gly547,Trp632,Ser548,Glu454,Glu764,Glu334这9个位点用snap gene软件分别设计了 NNK简并性引物,并构建9个小型的突变文库,基于研究院Biomek高通量平台建立快速筛选程序,从这9个突变文库中进行多次筛选,最终筛选出热稳定性较野生型提高的突变体;也推动了 Biomek自动化工作站的广泛应用。3.对野生型和热稳定性提高的突变体进行蛋白纯化,进而对野生型和突变体蛋白表征催化活性和失活动力学常数,尝试分析蛋白内在结构变化,以揭示氨基酸残基变化对其动力学稳定性的影响因素和分子作用机制,为头孢菌素C酰化酶进一步的改造提供酶学参考。(本文来源于《武汉大学》期刊2017-05-01）
刘新花,杨广宇,邓子新,谢渊,刘天罡[3]（2017）在《基于结构B因子分析指导的头孢菌素C酰化酶动力学稳定性改造》一文中研究指出【目的】筛选Pseudomonas sp.SE83 acy Ⅱ定点饱和突变库,获得动力学稳定性提高的头孢菌素C(CPC)酰化酶突变体,并对突变酶进行初步的结构-功能关系分析。【方法】靶标酶Pseudomonas sp.SE83 acy Ⅱ与Pseudomonas diminuta N176具有较高的同源性,通过分析N176的结构B因子,构建CPC酰化酶SE83定点饱和突变库;基于pH指示剂显色法,采用Biomek FX~P自动工作站建立CPC酰化酶高通量筛选方法,获得优良突变酶,对其活性、稳定性等酶学性质进行表征;利用SWISS-MODEL对突变体进行同源建模,探讨突变体结构与功能的关系。【结果】通过B因子分析和同源结构比对,共找出9个靶标位点;经过3轮筛选,发现R218及K226位点突变显着提高酶的热稳定性,其中最显着的R218Q和K226V在40°C的半衰期分别为野生型的3.77和2.77倍,催化效率k_(cat)/K_m分别为野生型的1.8和3.1倍。同源建模分析表明氢键作用和疏水相互作用的增加可能是突变体稳定性提高的原因。【结论】B因子指导的酶分子改造是一种高效可靠的动力学稳定性改造策略,突变体R218Q和K226V均可提高CPC酰化酶的稳定性和催化效率,对进一步的CPC酰化酶分子改造具有一定的参考价值和指导意义。(本文来源于《微生物学通报》期刊2017年06期）
朱琳琳,常雁红,姚舜,罗晖,于慧敏[4]（2017）在《重组头孢菌素C酰化酶的固定化研究》一文中研究指出将含头孢菌素C(CPC)酰化酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28-CPCAcy在50L发酵罐中发酵,发酵液OD600可达19.5,酶活达到11 542U·L~(-1);CPC酰化酶粗酶液经1%活性炭纯化后,比酶活由6.56U·mg~(-1)提高到10.77U·mg~(-1);然后将纯化的CPC酰化酶共价结合固定在氨基载体LX-1000HA和环氧基载体LX-1000EPC上,并对固定化酶的热稳定性及pH值稳定性进行考察。结果表明,LX-1000HA固定化酶的初始酶活较LX-1000EPC固定化酶低,但其热稳定性、pH值稳定性以及酶与载体的结合强度均高于LX-1000EPC固定化酶;并且在固定化酶投加量相同时,LX-1000HA固定化酶的催化性能优于LX-1000EPC固定化酶。对LX-1000HA固定化酶进行催化批次实验,在催化39批次时达到半衰期。(本文来源于《化学与生物工程》期刊2017年02期）
徐雪丽,胡又佳,谢丽萍,刘艳,张伟[5]（2016）在《头孢菌素C酰化酶的固定化》一文中研究指出本研究采用传统的包埋法、吸附法和共价结合法固定化头孢菌素C酰化酶,以表观酶活力回收率为指标,结果显示共价结合法的固定效果较好,其中ES-1载体固定化酶的表观酶活力回收率约30.9%。优化ES-1载体固定化条件,当酶的载量为150 u/g,磷酸钾缓冲液浓度1.0 mol/L,p H 9.5,25℃轻微振荡12 h,固定化效果较好,表观酶活力为60.73 u/g,表观酶活力回收率约40.5%。(本文来源于《中国医药工业杂志》期刊2016年04期）
聂自豪,罗晖,常雁红,刘天娇,李久凤[6]（2015）在《突变T7启动子以提高头孢菌素C酰化酶在大肠杆菌中表达》一文中研究指出头孢菌素C酰化酶(CCA)是一步法生产重要医药中间体7-氨基头孢烷酸的关键酶,已在重组大肠杆菌中采用T7启动子进行表达。通过对启动子进行突变是提高基因表达水平的有效手段之一,本文采用饱和突变的方法建立启动子突变库并进行筛选,以达到提高CCA在比较高的培养温度下的表达水平的目的。以大肠杆菌BL21(DE3)为表达(本文来源于《2015年中国化工学会年会论文集》期刊2015-10-17）
丁璐妹,肖慈英,储炬,钱江潮,张嗣良[7]（2015）在《内源信号肽DSE4介导头孢菌素C酰化酶在毕赤酵母中的分泌表达》一文中研究指出头孢菌素C(CPC)酰化酶可用于一步酶法合成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。对来自Pseudomonas sp.Strain SE83的高活性CPC酰化酶突变基因进行基于毕赤酵母偏好密码子优化,获得基因SECA。选取毕赤酵母内源信号肽DSE4,构建表达菌G/DSECA,首次在毕赤酵母中分泌了CPC酰化酶。与酿酒酵母α-交配因子前导肽(α-factor)相比,DSE4介导SECA的分泌表达效果更优,其介导SECA表达的胞内、外单位体积酶活分别比α-factor高65%和44%。分别以DSE4和α-factor为信号肽构建β-半乳糖苷酶表达菌G/DSEL与G/MFL,进一步考察DSE4介导异源蛋白的分泌效果,G/DSEL的胞内外单位体积酶活也均高于G/MFL。(本文来源于《华东理工大学学报(自然科学版)》期刊2015年04期）
孙勇[8]（2015）在《头孢菌素C酰化酶基因的合成和表达》一文中研究指出头孢菌素C(CPC)酰化酶是一类将CPC或戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)催化水解生成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的酰化酶,在头孢类药物的工业生产中有重要的应用价值。7-ACA作为头孢菌素的抗菌部位,是各类半合成头孢菌素类抗生素药物的重要中间体。在7-ACA工业化生产的方法中,化学法由于步骤多,条件苛刻,过程中产生有毒废液,逐渐被人们淘汰。酶法制备7-ACA均需要使用CPC酰化酶。两步酶法中氧化条件控制难度大、酶解路线长、设备费用高,而一步酶法反应步骤少,反应过程简洁,具有良好的应用前景,是理想的7-ACA生产方法。但是,由于目前CPC酰化酶对CPC活性普遍不高,产物对酶有严重的抑制作用,导致该工艺难以应用于工业生产。因此获得新的高活力的CPC酰化酶和改造已有的CPC酰化酶成为解决问题的关键。本文根据假单胞菌(Pseudomonas species strain SE83)中酰化酶的基因序列,并引入突变(Val122Ala-Gly140Ser-Phe58βAsn-Ile75βThr-Ile176βVal-Ala436βGlySer471βCys),将基因序列根据大肠杆菌密码子偏好性,降低GC含量,优化后全序列合成,片段全长2325bp,测序后符合预期。构建了具有T7启动子的重组质粒p ET28-CPCacy并在E.coil BL21(DE3)、E.coil BL21 star(DE3)、E.coil ROSETTA(DE3)、E.coil JM109(DE3)中构建表达,均成功表达。SDS-PAGE和质谱分析均表明基因成功转入大肠杆菌。经发酵后酶活分别为E.coil BL21(DE3)2.04 U/m L,E.coil BL21 star(DE3)1.2 U/m L,E.coil BL21 star(DE3)0.48 U/m L,E.coil JM109(DE3)1.36 U/m L。BL21(DE3)作为表达效果最佳的宿主菌,通过单因素实验确定培养基中各成分的量分别为:甘油12 g/L,酵母提取物27 g/L,牛肉膏15 g/L。采用响应面的方法优化其产酶培养基,优化后当培养基成分为:甘油11.99 g/L,酵母提取物26.83 g/L,牛肉膏15.23g/L。此时酶活最高,为3.68U/m L,是优化前酶活的1.8倍。2008年北京大学的安明[31]等人将源自(Pseudomonas species strain SE83)中酰化酶的基因序列构建在大肠杆菌表达。在优化的发酵培养基和培养条件后,CPC酰化酶的酶活为2.96 U/m L。本研究从里氏木霉QM9414中扩增获得丙酮酸脱羧酶(pdc)启动子(Spdc、)序列和终止子(Tpdc)序列,通过双酶切法依次将Spdc、CPCacy、Tpdc连接至质粒p PICZαA,构建表达载体p PIC-CPCacy。采用原生质体转化技术将表达载体p PIC-CPCacy和含有潮霉素抗性筛选标记的质粒p AN7-1共转化到里氏木霉QM9414。筛选得到10株含有目的基因的里氏木霉转化子,发酵培养后没有测到酰化酶活性。本论文将一个全新的CPC酰化酶基因在大肠杆菌中表达,并通过响应面优化产酶培养基,使其酶活有显着的提升。获得了一株具有高活性的CPC酰化酶工程菌,CPC酰化酶在7-ACA的制备中具有广泛的应用前景,是未来7-ACA制备工艺的方向,应用CPC酰化酶制备7-ACA能够优化其生产工艺,降低生产成本,具有很好的经济效益和社会效益。将基因转化并整合到里氏木霉基因组,尝试在真菌系统里表达原核基因,为将来CPC酰化酶在真菌中的表达提供理论基础。(本文来源于《深圳大学》期刊2015-06-30）
梅婷,张大龙,冯进辉,王敏,吴洽庆[9]（2015）在《自剪切及活性相关位点的组合突变提高头孢菌素C酰化酶水解活力》一文中研究指出7-氨基头孢烷酸是合成头孢类抗生素的重要中间体,利用头孢菌素C酰化酶直接催化头孢菌素C获得7-氨基头孢烷酸的一步酶法与其它方法相比更加经济和环保,其关键是获得高活性的头孢菌素C酰化酶.本文以来源于Pseudomonas sp.KAC-1的Ⅰ类头孢菌素C酰化酶(CPCase-kac)蛋白序列为模版,对其基因进行全局优化设计,人工合成目的基因,并克隆至表达载体p ET28b,实现了CPCase-kac的高效表达.但是重组蛋白CPCase-kac表达活性较低,且自剪切不彻底,表达蛋白中存在前体形式的CPCase-kac,而头孢菌素C酰化酶的自剪切和活性往往相关.对CPCase-kac分子中影响活性的Y150、Q220、F347氨基酸位点进行饱和突变发现,活力提高的突变体Q220W、Q220G其第二次自剪切明显降低,而活力提高的突变体Y150R、Y150N、Y150H、Y150W及F347H、F347Y,自剪切却没有显着影响.将这些突变进行组合,最终得到了比活力提高了8.3倍的突变体Y150W/Q220G/F347Y.虽然Y150W/Q220G/F347Y突变体活性显着提高,但是其也具有Q220G较差的第二次剪切的特性.同时发现,外部条件改变可以影响CPCase前体或α’亚基的继续自剪切.这些发现为进一步提高CPCase-kac活性及应用打下了基础.(本文来源于《应用与环境生物学报》期刊2015年03期）
丁璐妹[10]（2015）在《毕赤酵母内源信号肽的筛选及头孢菌素C酰化酶的分泌表达》一文中研究指出毕赤酵母(Pichia Pastoris)是重要的异源蛋白分泌表达宿主,需要由N-端信号肽介导外源蛋白的分泌。内源信号肽存在于毕赤酵母自身的分泌蛋白中,可被更好地被加工,可能表现出更高的分泌效率。头孢菌素C (CPC)酰化酶是一步酶法合成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的关键酶,具有很好的应用前景。为了获得可用于毕赤酵母分泌表达的有效信号肽序列,本课题采用生物信息学方法筛选毕赤酵母内源信号肽,通过酵母增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与p-半乳糖苷酶(β-gal)的分泌表达,考察内源信号肽的分泌表达效果,并利用它们实现CPC酰化酶的分泌表达。利用SignalP4.1软件,从毕赤酵母分泌蛋白组中筛选得到具有分泌潜力的4个内源分泌信号序列：DAN4、GAS1'、MSB2与FRE2。以广泛应用的酿酒酵母α-交配因子(α-MF)信号肽以及文献报道的内源信号肽DSE4为对照,考察4个信号肽的分泌表达效果。利用突变的组成型强启动子PGI调控外源蛋白表达,构建含不同信号肽的外源蛋白表达载体和重组菌。所用CPC酰化酶(SECA)基因是对来自Pseudomonas sp. Strain SE83的高活性CPC酰化酶基因进行密码子优化后人工合成所得。经培养条件初步优化后,在摇瓶中检测EGFP、β-gal和SECA的胞内外表达水平。结果显示,MSB2介导叁种蛋白的分泌效果均优于a-MF与DSE4。DAN4有利于β-gal与SECA的分泌,但对EGFP的分泌效果较差。GAS1’对β-gal的分泌效果最好,但不利于EGFP与SECA的分泌。FRE2对EGFP与β-gal的分泌效果尚可,但是不及对照DSE4,且对SECA的分泌效果最差。综合叁种蛋白的分泌情况,可认为MSB2信号肽介导异源蛋白的分泌效果最好,其对EGFP、β-gal与SECA的分泌水平分别为a-MF的1.50、7.97和1.94倍。对于SECA的分泌表达,DAN4介导的分泌效果最好,分泌水平可达a-MF和DSE4的3.81和2.65倍。获得分泌表达SECA的单拷贝菌株后,提高Zeocin浓度筛选得到高抗性菌株G/MSBCAm,可进一步提高分泌表达水平,胞内外酶活分别比低抗性菌株G/MSBCA提高28.4%和53.2%。(本文来源于《华东理工大学》期刊2015-04-20）
头孢菌素酰化酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目前,半合成头孢菌素类在抗生素市场占据着重要地位,7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是生产半合成头孢菌素类抗生素的关键中间体,一步酶法可以通过头孢菌素C酰化酶直接酰化头孢菌素C(CPC)获得7-ACA。但CPC酰化酶在应用中仍存在对热敏感、稳定性不佳等问题,提高其热稳定性以进一步推动其工业应用。本论文以酰化酶蛋白晶体结构的B因子的数值作为筛查突变热点的准则,确定可能影响CPC酰化酶热稳定性的关键氨基酸残基,利用蛋白质工程手段改造CPC酰化酶分子,期望得到热稳定性提高的酰化酶突变体。本研究人工合成了叁段不同菌株来源的头孢菌素C(CPC)酰化酶,构建应用于大肠杆菌表达系统的重组质粒和菌株,发现其中仅Pseudomonas sp.SE.83 acyII S12 对CPC活性最高。Pseudomonas sp.SE83 acyII S12 基因编码 83kDa 的多肽前体,其前体经自剪切可得到25 kDa α亚基和58 kDa β亚基组成的成熟蛋白。以Pseudomonas sp.SE83 acyＩＩ S12为研究对象主要进行了以下研究:1.从PDB数据库中搜索cephalosporin acylase获得19个晶体数据,结合序列相似性及分析B因子值时对晶体分辨率有一定的要求等指标,最终选择PDB号为4HSR的晶体结构和数据作为本实验中分析SE83 acyＩＩ S12突变位点选择的模板参照。利用discovery studio软件计算得出4HSR蛋白质中氨基酸残基位点B因子数值及其氨基酸的类型并排序,比对4HSR与SE83 acyＩＩ S12多肽链的氨基酸残基α、β序列,在SE83 acyＩＩ S12多肽链中,选择与4HSR中较高B因子值对应的氨基酸残基作为潜在的突变热点。2.针对 Arg218,Lys226,Glu113,Gly547,Trp632,Ser548,Glu454,Glu764,Glu334这9个位点用snap gene软件分别设计了 NNK简并性引物,并构建9个小型的突变文库,基于研究院Biomek高通量平台建立快速筛选程序,从这9个突变文库中进行多次筛选,最终筛选出热稳定性较野生型提高的突变体;也推动了 Biomek自动化工作站的广泛应用。3.对野生型和热稳定性提高的突变体进行蛋白纯化,进而对野生型和突变体蛋白表征催化活性和失活动力学常数,尝试分析蛋白内在结构变化,以揭示氨基酸残基变化对其动力学稳定性的影响因素和分子作用机制,为头孢菌素C酰化酶进一步的改造提供酶学参考。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
头孢菌素酰化酶论文参考文献
[1].罗晖,汪月,刘婧冉,仝双明,常雁红.头孢菌素C酰化酶的固定化策略及其对酶学性质的影响[C].第十二届中国酶工程学术研讨会论文摘要集.2019
[2].刘新花.筛选B因子分析改造的头孢菌素C酰化酶突变体[D].武汉大学.2017
[3].刘新花,杨广宇,邓子新,谢渊,刘天罡.基于结构B因子分析指导的头孢菌素C酰化酶动力学稳定性改造[J].微生物学通报.2017
[4].朱琳琳,常雁红,姚舜,罗晖,于慧敏.重组头孢菌素C酰化酶的固定化研究[J].化学与生物工程.2017
[5].徐雪丽,胡又佳,谢丽萍,刘艳,张伟.头孢菌素C酰化酶的固定化[J].中国医药工业杂志.2016
[6].聂自豪,罗晖,常雁红,刘天娇,李久凤.突变T7启动子以提高头孢菌素C酰化酶在大肠杆菌中表达[C].2015年中国化工学会年会论文集.2015
[7].丁璐妹,肖慈英,储炬,钱江潮,张嗣良.内源信号肽DSE4介导头孢菌素C酰化酶在毕赤酵母中的分泌表达[J].华东理工大学学报(自然科学版).2015
[8].孙勇.头孢菌素C酰化酶基因的合成和表达[D].深圳大学.2015
[9].梅婷,张大龙,冯进辉,王敏,吴洽庆.自剪切及活性相关位点的组合突变提高头孢菌素C酰化酶水解活力[J].应用与环境生物学报.2015
[10].丁璐妹.毕赤酵母内源信号肽的筛选及头孢菌素C酰化酶的分泌表达[D].华东理工大学.2015
论文知识图
