戊型肝炎疫苗广谱保护性的分子机制研究

论文摘要

戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）可导致病毒性肝炎——戊型肝炎（HepatitisE,HE）。戊型肝炎病毒在许多国家都有较广泛的流行。戊型肝炎病毒的衣壳蛋白含有660个氨基酸,该蛋白的截短蛋白E2（a.a.394-606）包含宿主识别病毒所必需的结构域,并且含有免疫优势表位,对E2进行改造,将其N端延长至368位氨基酸可得到类病毒颗粒p239,并且表达出可以在体外组装成颗粒的p239蛋白采用大肠杆菌表达系统。p239蛋白即戊型肝炎疫苗,通过临床研究发现基因1型的疫苗可以对1/4型的病毒感染具有良好且持久的保护。本研究主要目的是对戊型肝炎疫苗广谱保护性的分子机制进行研究,通过应用高效抗原特异性人源单克隆抗体筛选平台,从疫苗免疫者外周血中筛选出相应抗体并进行鉴定。主要方法是使用分选型流式细胞仪分选获得PBMC中抗原特异性的记忆B细胞,对其进行单细胞RT-PCR获得抗体序列,最终通过表达及筛选获得34株戊型肝炎特异性的人源抗体。之后对获得的HEV疫苗接种者的特异性抗体性质进行检测,通过检测发现超过80%的抗体与不同基因型的p239蛋白结合活性都较强,88.24%的抗体与1/4型的p239蛋白具有相当的结合活性。94.12%的抗体都具有中和活性。对抗体识别的表位进行研究,发现大部分抗体识别C2表位,提示C2表位为人源抗体的免疫优势表位。C2表位的敏感性氨基酸在不同基因型病毒中具有保守性。综上所述,本研究通过抗原特异性人源单克隆抗体筛选平台,成功筛选到抗原特异性的人源抗体,为研究多种病原体相关抗体打下基础;通过对人源抗体的性质检测及分析,发现HEV疫苗高保护率及广谱保护性的原因,这可以进一步通过深度测序的方法对抗体的演化过程进行分析,也可以为其他高保护率疫苗的设计提供理论支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 绪论
•   1. 戊型肝炎病毒
•     1.1 戊型肝炎病毒的发现
•     1.2 戊型肝炎的感染及治疗
•     1.3 戊型肝炎病毒的基因型及流行
•     1.4 戊型肝炎病毒的病毒体
•     1.5 戊型肝炎病毒衣壳蛋白相关研究
•   2. 戊型肝炎疫苗的研究进展
•     2.1 戊肝疫苗TrpE-C2的相关研究
•     2.2 戊肝疫苗rHEV的相关研究
•     2.3 戊肝疫苗p239的研发
•     2.4 p239疫苗的临床实验及保护率
•   3. 单克隆抗体研究概述
•     3.1 抗体的结构和类型
•     3.2 单克隆抗体的获取
•     3.3 单克隆抗体的应用
•   4. 本论文的研究目的和意义
• 第二章 材料与方法
•   1. 材料
•     1.1 主要仪器
•     1.2 主要实验耗材
•     1.3 主要试剂
•     1.4 细胞菌株、质粒、和实验动物
•     1.5 实验用溶液和培养基配制
•     1.6 分子克隆实验中所涉及使用的引物
•   2. 方法
•     2.1 单细胞分选
•     2.2 单细胞PCR
•     2.3 分子克隆
•     2.4 蛋白的表达
•     2.5 人源单克隆抗体表达
•     2.6 抗体的性质测定
• 第三章 结果与分析
•   第一部分 戊型肝炎病毒特异性的人源抗体的获取
•     1. HEV特异性记忆B细胞获取
•       1.1 疫苗接种志愿者的选取及免疫
•       1.2 疫苗接种者体内的戊肝特异性抗体分析
•       1.3 p239的获取及HEV特异记忆B细胞染色
•       1.4 戊型肝炎病毒特异性记忆B细胞分选
•     2. 单细胞PCR获得抗体基因
•     3. 克隆及抗体的表达
•       3.1 表达克隆的构建
•       3.2 抗体的小量表达
•       3.3 抗体的大量表达及鉴定
•   第二部分 戊型肝炎病毒特异性的人源抗体的性质分析
•     1. 抗体的序列分析
•       1.1 抗体的轻重链家系分析
•       1.2 戊肝特异性抗体的序列分析
•     2. 抗体结合活性检测
•       2.1 抗体与不同基因型的E2与p239的结合活性
•       2.2 抗体与1型和4型的p239蛋白的结合活性相关性分析
•     3. 抗体中和活性检测
•       3.1 抗体基于Kernow病毒的中和数据
•       3.2 抗体的中和活性与1、4型p239蛋白的结合活性相关性分析
•       3.3 抗体的中和活性与序列家系分析
•     4. 抗体的表位分类
•       4.1 抗体阻断鼠源单克隆抗体性质分析
•       4.2 抗体关键识别位点鉴定
•       4.3 抗体丙氨酸扫描和交叉阻断实验的综合分析
• 第四章 讨论
•   1. 戊肝疫苗广谱保护性的分子机制讨论
•   2. 鼠源抗体与人源抗体的对比
•   3. IGHV1-69家系产生的中和抗体的讨论
• 第五章 小结与展望
•   1. 小结
•   2. 展望
• 参考文献
• 致谢
• 发表文章

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张旭

导师: 郑子峥

关键词: 疫苗,戊型肝炎病毒,人源单克隆抗体

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 厦门大学

分类号: R392

总页数: 109

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