重金属铜对斑马鱼胚胎发育毒性作用的研究

论文摘要

经济的快速发展造成了日益严重的环境污染问题,重金属排放量逐年增加,重金属污染已经成为我国水环境污染的突出问题之一。铜作为水生生物必需的营养元素之一,既是大自然广泛存在的一种过渡金属元素,也是生物体参与重要生命活动的酶类的组成成分。随着硫酸铜作为水产养殖药物和饲料添加剂被大量使用,水体中铜的污染日益严重,研究表明溶解态的铜毒性最强,毒性范围广阔,本文就溶解态的铜对水生动物的胚胎发育毒性作用及其机制进行了初步研究。选取技术标准成熟的斑马鱼作为模式生物,采用急性暴露实验（96 h）研究Cu2+对斑马鱼胚胎的发育毒性作用。结果显示:铜对斑马鱼胚胎有明显的致死、致畸和抑制孵化效应,表现为发育迟缓,色素沉积缓慢,孵化延迟或者不孵化,其96 h的LC50为4.122 mg/L。进一步研究显示:Cu2+低浓度下的即可抑制斑马鱼的胚胎发育,当浓度高于0.20 mg/L可导致其孵化率为零。采用流式细胞术、Long-PCR、RT-PCR等方法对Cu2+所致斑马鱼胚胎的细胞凋亡、线粒体生物发生、基因表达量以及抗氧化酶活性进行了检测。流式细胞仪检测结果显示:4.122 mg/L的铜离子处理胚胎24 h的细胞凋亡率为25%,总ROS水平和线粒体源ROS也显著升高,线粒体膜电势下降,线粒体质量数减少,说明Cu2+可以催化氧化还原反应产生大量的ROS,引起氧化应激,导致线粒体数量减少进而造成细胞凋亡。Long-PCR结果显示,线粒体DNA（mtDNA）的氧化损伤程度随着Cu2+浓度的升高和作用时间的增长而增强,并呈现时间-剂量效应。在正常情况下,鱼类与其他生物体一样,通过超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶的作用清除ROS,抑制体内ROS升高,SOD和CAT活性测定显示:4.122 mg/L和0.20 mg/L的铜离子处理胚胎至96 h,斑马鱼胚胎CAT活性和SOD活性都呈下降趋势。丙二醛（MDA）作为检测脂质过氧化含量的指标被广泛应用,MDA结果显示,随着铜离子浓度的增大以及处理时间的延长,MDA含量升高,说明长时间的暴露使得其氧化损伤严重,MDA的含量的变化与抗氧化酶活性的变化趋势相符。RT-PCR检测mRNA表达的结果显示:4.122 mg/L和0.20 mg/L的铜离子处理胚胎,CAT和SOD基因的表达量呈现先升高后降低的趋势,说明机体通过上调SOD和CAT基因的表达量来降低体内ROS的含量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1 文献综述
•   1.1 重金属的污染现状
•     1.1.1 重金属铜污染及其毒害作用
•     1.1.2 铜的体内代谢调节
•     1.1.3 铜与氧化应激效应关系
•     1.1.4 铜与线粒体
•   1.2 重金属铜对鱼类的毒性效应
•     1.2.1 重金属铜对鱼类的早期发育的影响
•     1.2.2 重金属铜对鱼类生理生化作用的影响
•   1.3 模式生物斑马鱼的毒理学研究
•     1.3.1 斑马鱼的简介
•     1.3.2 斑马鱼的研究概况
•     1.3.3 斑马鱼的优势
•   1.4 本研究的目的、内容和意义
•     1.4.1 研究目的与内容
•     1.4.2 研究意义
• 2+对斑马鱼胚胎发育的急性毒性实验'>2 Cu²⁺对斑马鱼胚胎发育的急性毒性实验
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 材料
•     2.1.2 仪器
•     2.1.3 溶液的配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 成年斑马鱼的饲养
•     2.2.2 斑马鱼胚胎的收集
•     2.2.3 斑马鱼胚胎的选择
•     2.2.4胚胎染毒实验
•   2.3 统计学分析
•   2.4 结果
• 2+对斑马鱼胚胎发育进程及形态的影响'>    2.4.1 Cu²⁺对斑马鱼胚胎发育进程及形态的影响
• 2+对斑马鱼胚胎死亡率的影响'>    2.4.2 Cu²⁺对斑马鱼胚胎死亡率的影响
•   2.5 讨论
• 3 斑马鱼胚胎细胞ROS、线粒体质量数及膜电势的测定
•   3.1 斑马鱼胚胎细胞总ROS的测定
•     3.1.1 材料
•     3.1.2 仪器
•     3.1.3 溶液的配制
•     3.1.4 实验方法
•   3.2 斑马鱼胚胎线粒体源ROS的测定
•     3.2.1 溶液的配制
•     3.2.2 实验方法
•   3.3 斑马鱼胚胎细胞线粒体质量数的测定
•     3.3.1 溶液的配制
•     3.3.2 实验方法
•   3.4 斑马鱼胚胎细胞线粒体膜电势的测定
•     3.4.1 溶液的配制
•     3.4.2 实验方法
•   3.5 统计学分析
•   3.6 结果
• 2+对斑马鱼胚胎细胞总ROS、线粒体源ROS的影响'>    3.6.1 Cu²⁺对斑马鱼胚胎细胞总ROS、线粒体源ROS的影响
• 2+对斑马鱼胚胎线粒体数的影响'>    3.6.2 Cu²⁺对斑马鱼胚胎线粒体数的影响
• 2+对斑马鱼胚胎细胞线粒体膜电势的影响'>    3.6.3 Cu²⁺对斑马鱼胚胎细胞线粒体膜电势的影响
•   3.7 讨论
• 2+对斑马鱼胚胎凋亡、mtDNA损伤、mRNA表达量的影响'>4 Cu²⁺对斑马鱼胚胎凋亡、mtDNA损伤、mRNA表达量的影响
•   4.1 Annexin V-FITC法、AO法检测斑马鱼胚胎细胞凋亡情况
•     4.1.1 材料
•     4.1.2 仪器
•     4.1.3 溶液的配制
•     4.1.4 实验方法
•   4.2 斑马鱼胚胎mt DNA损伤测定
•     4.2.1 材料
•     4.2.2 仪器
•     4.2.3 溶液的配制
•     4.2.4 实验方法
•   4.3 斑马鱼胚胎m RNA表达量的测定
•     4.3.1 材料
•     4.3.2 仪器
•     4.3.3 溶液的配制
•   4.4 统计学分析
•   4.5 结果
• 2+对斑马鱼胚胎细胞凋亡的影响'>    4.5.1 Cu²⁺对斑马鱼胚胎细胞凋亡的影响
• 2+对斑马鱼胚胎mt DNA损伤的影响'>    4.5.2 Cu²⁺对斑马鱼胚胎mt DNA损伤的影响
• 2+对斑马鱼胚胎m RNA表达量的影响'>    4.5.3 Cu²⁺对斑马鱼胚胎m RNA表达量的影响
•   4.6 讨论
• 2+对斑马鱼胚胎抗氧化酶活性影响的测定'>5 Cu²⁺对斑马鱼胚胎抗氧化酶活性影响的测定
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 材料
•     5.1.2 仪器
•     5.1.3 溶液的配制
•     5.1.4 实验方法
•   5.2 统计学分析
•   5.3 结果
• 2+对斑马鱼胚胎超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响'>    5.3.1 Cu²⁺对斑马鱼胚胎超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响
• 2+对斑马鱼胚胎过氧化氢酶（CAT）活性的影响'>    5.3.2 Cu²⁺对斑马鱼胚胎过氧化氢酶（CAT）活性的影响
• 2+对斑马鱼胚胎丙二醛（MDA）活性的影响'>    5.3.3 Cu²⁺对斑马鱼胚胎丙二醛（MDA）活性的影响
•   5.4 讨论
• 6 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 展望
• 致谢
• 参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 宋明霞

导师: 许波

关键词: 斑马鱼,氧化胁迫,发育毒性,线粒体

来源: 烟台大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用

单位: 烟台大学

分类号: X171.5

总页数: 73

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