THAP11对造血干细胞功能与发育的调控作用研究

论文摘要

THAP11是THAP蛋白（Thanatos-associated protein）家族中的最新成员,人THAP11在小鼠中的同源基因称作Ronin。Ronin最早发现于小鼠胚胎发育早期阶段,其对于体内和体外维持胚胎干细胞多能性都是必须的。现有研究显示,THAP11主要通过转录因子相互作用网络调控细胞的增殖、分化、凋亡及线粒体功能,主要体现在抑制肿瘤细胞的生长、调节胚胎干细胞的干性和调控多能干细胞的增殖与分化的过程中。但THAP11对造血干细胞的调控作用仍未见报道。我们实验室前期研究发现,在红白血病细胞系（K562）中,THAP11调控红系/巨核系分化平衡,这提示我们THAP11可能在造血调控过程中发挥着重要作用。本研究利用人原代脐带血CD34+细胞以及条件性敲除小鼠模型,系统分析了THAP11对HSC功能以及造血系统发育的影响。基于RNAi慢病毒系统,敲低人脐带血（Cord blood,CB）CD34+细胞中THAP11基因表达,检测THAP11对HSC体内重建、体外生长、增殖、周期以及凋亡的影响。结果显示,将敲低THAP11的CB CD34+细胞移植入经致死剂量照射的免疫缺陷小鼠中,移植后三个月,THAP11干涉组人源GFP+细胞重建率明显低于对照组。体外集落培养实验结果显示,敲低THAP11后,CB CD34+细胞成集落能力显著降低,且与干涉效率相关。而体外扩增培养体系中,THAP11干涉后,CB CD34+细胞在体外培养的过程中增殖速率降低,CB CD34+细胞周期进展阻滞在G0/G1期,撤除所有细胞因子,THAP11干涉组细胞凋亡增多。在巨核系诱导培养体系中,敲低THAP11后CB CD34+细胞向巨核系分化减少;在红系诱导培养体系中,敲低THAP11后CD34+细胞向红系分化也减少。以上研究结果表明,THAP11对人造血干细胞功能有重要的调控作用,但调控作用机制还需进一步研究。本研究在实验室前期研究基础上,基于LoxP-Cre系统构建了Ronin基因造血系统条件性敲除（Conditional Knockout,CKO）小鼠,统计Roninflox/flo x（flanked by loxP）基因型小鼠与Roninflo x/+Vav-iCre+基因型小鼠交配后产生子代基因型比例,结果显示Roninflox/flo xVav-iCre+基因型的小鼠实际出生率不符合孟德尔定律,仅有1只小鼠出生且在一周内死亡,表明造血系统特异敲除Ronin导致胚胎无法存活。进一步解剖13.5dpc（days post coitum）、14.5dpc、15.5dpc和18.5dpc孕鼠胚胎,观察Ronin CKO小鼠形态学表型,结果显示Ronin CKO小鼠胚胎通体苍白,卵黄囊、胎盘、胎肝三个主要造血器官明显发白,且随着时间的推移,形态学表型加重,胎肝变小且细胞数量减少,循环血中红细胞脱核比降低,胚胎表现出严重贫血表型。进一步分析13.5dpc、14.5dpc和15.5dpc孕鼠胚胎胎肝中细胞组成,利用CD71和TER119标记不同发育阶段红细胞,结果显示,红系发育在CD71hiTer119+细胞阶段受到阻滞,阻滞发生在细胞由大到小的进展过程中,且整个胎肝中Ter119+细胞严重减少。利用Lin-c-Kit+Sca1-标记造血祖细胞（Hematopoietic progenitor cell,HPC）、Lin-c-Kit+Sca1+标记造血干细胞（Haematopoietic stem cell,HSC）,分析胎肝中造血干、祖细胞组成。结果显示,13.5天时Ronin CKO小鼠胎肝中Lin-c-Kit+Sca1+细胞数量显著增多,随着胚胎的发育至15.5天时细胞数量无明显差异;13.5天时,Lin-c-Kit+Sca1-细胞数量无明显差异,至15.5天时,Lin-c-Kit+Sca1-细胞数量显著减少。体外集落形成实验的结果显示,Ronin缺失后13.5dpc胎肝细胞集落成能力显著低降。此外,13.5dpc、14.5dpc和15.5dpc Ronin CKO小鼠胎肝中细胞凋亡均显著增加。Ronin CKO小鼠模型的建立证实Ronin是造血系统发育过程中必须的调节因子,条件性敲除导致小鼠胚胎严重缺血,无法正常存活。胚胎表型的初步检测结果提示,Ronin在造血早期发育过程中的调控作用于两个节点:一方面,在胚胎红系发育过程中,Ronin条件性缺失阻滞红系终末分化,难以产生成熟红细胞,导致胚胎严重贫血;另一方面,Ronin条件性缺失影响了造血干、祖细胞功能,最终导致胚胎整个造血系统发育障碍。综上所述,本研究在敲低THAP11表达的人CB CD34+原代细胞模型和Ronin CKO小鼠模型中研究了THAP11对造血干细胞功能以及造血系统发育的调控作用,证实THAP11是调控造血干细胞功能及造血系统发育过程中必需的调控因子,并为后续机制研究提供了可靠线索和动物模型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1.前言
•   1.1 .THAP11 简介
•   1.2 .造血系统的发育
•   1.3 .人造血干细胞移植免疫缺陷小鼠模型
•   1.4 .本课题研究基础及研究意义
• 2.材料与方法
•   2.1 .实验仪器与材料
•     2.1.1 .实验仪器
•     2.1.2 .实验试剂
•     2.1.3 .实验细胞、菌株及质粒
•     2.1.4 .实验动物
•   2.2 .实验方法
• +细胞分离及培养'>    2.2.1 .CB CD34⁺细胞分离及培养
•     2.2.2 .THAP11 干涉慢病毒的制备及感染
•     2.2.3 .异种移植模型的建立
•     2.2.4 .Ronin CKO小鼠的制备
•     2.2.5 .小鼠基因型鉴定
•     2.2.6 .小鼠胚胎解剖
•     2.2.7 .流式细胞分析
•     2.2.8 .蛋白提取与Western blot检测
•     2.2.9 .集落形成检测
•     2.2.10 .统计学分析
• 3.结果
• +细胞重建能力降低'>  3.1 .异种移植模型中敲低THAP11 导致CBCD34⁺细胞重建能力降低
•     3.1.1 .异种移植模型条件优化
•     3.1.2 .THAP11 RNAi慢病毒干涉效率检测
• +细胞重建能力降低'>    3.1.3 .敲低THAP11后CB CD34⁺细胞重建能力降低
• +细胞的影响'>  3.2 .体外培养实验检测敲低THAP11对CB CD34⁺细胞的影响
• +细胞集落形成能力降低..'>    3.2.1 .敲低THAP11 导致CB CD34⁺细胞集落形成能力降低..
• +细胞在液体扩增培养中细胞增殖速率降低'>    3.2.2 .敲低THAP11 导致CB CD34⁺细胞在液体扩增培养中细胞增殖速率降低
•     3.2.3 .敲低THAP11 导致CD34+细胞周期阻滞在G0/G1期..
• +细胞在撤除细胞因子后的凋亡增多'>    3.2.4 .敲低THAP11 导致CD34⁺细胞在撤除细胞因子后的凋亡增多
• +细胞向巨核系分化减少'>    3.2.5 .敲低THAP11后CD34⁺细胞向巨核系分化减少
• +细胞向红系分化减少'>    3.2.6 .敲低THAP11后CD34⁺细胞向红系分化减少
•   3.3 .Ronin造血系统条件性敲除小鼠因贫血而胚胎致死
•     3.3.1 .Ronin CKO小鼠出生率不符合孟德尔定律
•     3.3.2 .Ronin CKO小鼠胚胎贫血且胎肝发育不全
•     3.3.3 .Ronin CKO小鼠红细胞脱核比降低
•     3.3.4 .Ronin CKO小鼠胎肝中红细胞发育受阻
•     3.3.5 .Ronin CKO小鼠胎肝造血干、祖细胞异常
•     3.3.6 .Ronin CKO小鼠胎肝细胞集落形成能力降低
•     3.3.7 .Ronin CKO小鼠胎肝凋亡增多
• 4.讨论
• 5.结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
•   参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李秀

导师: 李长燕

关键词: 造血干细胞,条件性基因敲除,造血系统发育

来源: 安徽医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 安徽医科大学

分类号: Q344

总页数: 83

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