CRISPR/Cas9介导的外源基因靶向插入鸡EAV-HP基因组

论文摘要

本研究旨在通过CRISPR/Cas9介导外源基因靶向插入鸡EAV-HP基因组。首先设计特异性引物并扩增鸡内源性病毒（EAV-HP）左右同源臂和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因表达盒,然后通过重叠延伸PCR技术将两个同源臂DNA连接至eGFP表达盒两侧,获得全长DNA片段LER,并克隆至pMD19-T载体,获得携带eGFP基因的供体载体pMDT-LER。随后在HEK293T细胞中验证供体载体pMDT-LER能成功表达eGFP后,将EAV-HP打靶载体和供体载体共转染至DF-1细胞,观察绿色荧光阳性细胞,提取细胞基因组,PCR检测外源基因eGFP成功整合至鸡基因组EAV-HP位点。最后,将转基因细胞DF-1传至第7代,用PCR和Western blotting检测eGFP在转基因细胞中稳定表达。文中初步验证外源基因eGFP能整合至鸡EAV-HP位点并稳定表达,为转基因鸡的研究提供新整合位点。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 实验材料
•   1.2 供体载体的构建
•     1.2.1 PCR引物设计
•     1.2.2 EAV-HP左右同源臂DNA片段及eGFP表达盒扩增
•     1.2.3 重叠PCR连接DNA片段
•   1.3 eGFP表达验证
•   1.4 打靶载体和供体载体共转染鸡细胞系
• 2 结果与分析
•   2.1 供体载体构建及鉴定
•   2.2 供体载体表达验证
•   2.3 转基因细胞系检测
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 郭苗苗,杨理凯,杜伟立,张涛,路宏朝,王令

关键词: 鸡内源性病毒,整合位点,供体载体

来源: 生物工程学报 2019年02期

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 陕西理工大学生物科学与工程学院

基金: 国家自然科学基金(No.31402071),陕西理工大学科研计划(No.SLGQD14-02)资助~~

分类号: Q78;S831

DOI: 10.13345/j.cjb.180224

页码: 236-243

总页数: 8

文件大小: 1598K

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