导读:本文包含了重组牛凝血酶原论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:凝血酶原,凝血酶,丙烯酰胺,凝胶,复性,组织,水蛭。
重组牛凝血酶原论文文献综述
樊宇,唱韶红,巩新,刘波,吴军[1]（2016）在《毕赤酵母表达重组人凝血酶原2及活性分析》一文中研究指出目的通过毕赤酵母(Pichia pastoris)表达制备重组人凝血酶原2(prothrombin-2),并利用锯鳞蝰(Echis carinatus)凝血酶原激活剂ecarin将其活化为凝血酶,分析凝血酶的活性。方法根据Gen Bank公布的人凝血酶原2和ecarin的cDNA序列,设计并优化合成凝血酶原2和ecarin基因。将凝血酶原2基因构建至表达载体p PICZαA中,转化并筛选重组凝血酶原2的糖基工程酵母菌,诱导工程酵母分泌表达凝血酶原2,培养上清中的目的蛋白经两步阳离子层析纯化制备,并利用酶切N-糖链和肽指纹图谱分析鉴定目的蛋白。将ecarin基因构建到表达载体pcDNA3.1(+),瞬转HEK 293T细胞,收集培养上清。将HEK 293T工程细胞培养上清与纯化的凝血酶原2反应,利用凝血酶发色底物S-2238,测反应产物的酶促活性;利用血浆纤维蛋白原测反应产物的血凝时间、分析血凝活性。结果酵母表达凝血酶原2的培养上清经纯化获得37×103的目的蛋白,去除N-糖链的蛋白相对分子质量降为35×103,与凝血酶原2理论分子量一致。经肽指纹图谱鉴定,纯化得到的蛋白为凝血酶原2。制备的凝血酶原2经HEK 293T细胞表达ecarin的培养上清处理后,可催化S-2238解离产生黄色的对硝基苯胺(pNA),且pNA产生的光密度值随着处理的凝血酶原2的增加而升高;经ecarin处理的凝血酶原2能促进血浆凝结,与凝血酶试剂的血凝时间接近,且血凝时间随着处理的凝血酶原2的量减少而延长。结论利用毕赤酵母制备了重组人凝血酶原2,被ecarin活化为具有活性的凝血酶,有望替代从血浆中提取的凝血酶原,用于战伤救治和临床研究。(本文来源于《军事医学》期刊2016年08期）
樊宇[2]（2016）在《糖基工程酵母表达重组人凝血酶原2和丁酰胆碱酯酶的研究》一文中研究指出随着基因工程技术的快速发展、蛋白质药物需求量的递增,各种蛋白药物表达平台相继面世,毕赤酵母作为一种最简单的真核表达系统越来越受到人们的重视。但野生酵母分泌的糖蛋白存在过甘露糖修饰的问题,存在较强的免疫原性,限制了该系统的发展和应用。本实验室前期已经成功敲除了毕赤酵母过度甘露糖修饰的相关基因,阻断了毕赤酵母的表达蛋白的高甘露糖基化,然后将复杂型糖基修饰的相关基因整合到毕赤酵母基因组上,获得能够合成哺乳动物复杂糖型的糖基工程酵母,成功用于蛋白质药物的表达制备。凝血酶(α-thrombin)是参与凝血过程中的重要蛋白酶,被广泛用于临床救治。丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase, BChe)可水解丁酰胆碱和可卡因,防止因神经递质积累而引起神经中毒,还能特异性地结合有机磷毒剂和农药,预防和治疗有机磷中毒。目前凝血酶和丁酰胆碱酯酶的主要来源,是从哺乳动物和人类的血制品中提取制备。但是这种生产方法受到环境和血源的制约,产量难以满足不了临床需求。糖基工程酵母兼具酵母的快速、高效表达和哺乳动物细胞的复杂型糖基修饰能力,本实验基于实验室构建的糖基工程酵母表达平台,表达重组人凝血酶原2和丁酰胆碱酯酶两种糖蛋白,探索糖基工程酵母在表达外源糖蛋白方面的应用前景。1.糖基工程酵母表达凝血酶原2的研究合成凝血酶原2的基因,构建至毕赤酵母表达载体中,转化筛选重组工程酵母菌,诱导表达培养,培养上清经SPFF和Unisp两步阳离子层析纯化,SDS-PAGE电泳图中得到37 kDa的目的条带。纯化样品经PNGaseF酶切处理,SDS-PAGE电泳图中去除糖链的蛋白分子量为35 kDa,与理论大小一致。肽图分析的结果进一步证明纯化得到的糖蛋白为凝血酶原2。2.毕赤酵母和哺乳动物细胞293T表达Ecarin的研究在体外,凝血酶原激活剂Ecarin可以将凝血酶原活化为凝血酶。为了得到活化的凝血酶,我们在毕赤酵母和293T细胞中开展了表达Ecarin的研究。全基因合成Ecarin序列,构建至毕赤酵母表达载体中,在毕赤酵母表达系统中,尝试了胞内表达和分泌表达的两种形式,均未获得有活性的Ecarin, Western Blot也未检测到特异性条带。哺乳动物293T细胞瞬时表达Ecarin,收集培养上清,加入293T细胞表达的Ecarin培养上清的凝血酶原2,将S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl)降解为pNA,产生淡黄色颜色反应；未加Ecarin培养上清的的凝血酶原2与S-2238没有颜色变化,表明哺乳动物293T细胞表达的Ecarin可以将糖基工程酵母表达的凝血酶原2活化为有活性的凝血酶。3.凝血酶原-2的活性研究利用发色底物吸光值的变化测Ecarin舌化凝血酶原2的剂量关系,发现当纯化的凝血酶原2的量不变时,随着293T表达Ecarin培养上清的增加,S-2238被降解产生的吸光值也相应的增加,说明Ecarin对prethrombin-2的活化具有剂量依赖性。纯化的凝血酶原2经Ecarin舌化后,可以促进小鼠血浆发生凝集,凝血时间为16s,以TT试剂盒中的凝血酶作为阳性对照,它与血浆反应的凝血时间为27s,说明凝血酶原2活化后具有血凝活性。4.野生型酵母表达不同形式的丁酰胆碱酯酶本实验利用糖基工程酵母表达制备重组人丁酰胆碱酯酶。在野生型酵母X33中表达不同结构的丁酰胆碱酯酶,比较不同结构的丁酰胆碱酯酶的表达量和活性差异,选取长效的丁酰胆碱酯酶用于糖基工程酵母的表达和酶活研究。全基因合成丁酰胆碱酯酶基因,构建毕赤酵母表达载体,并转化到野生型酵母X33中诱导表达培养,收集的培养上清经SDS-PAGE电泳分析,电泳图中观察不到目的蛋白条带。通过胆碱酯酶比色法测酶活,发现表达BChe勺培养上清可降解特异性底物碘化硫代丁酰胆碱(BSCh),与显色剂DTNB发生颜色反应,检测到吸光值变化。与稀释40倍的小鼠血清比较,只有后者酶活的80%左右,说明表达量较低。利用野生型酵母X33尝试表达丁酰胆碱酯酶单体的研究。天然的丁酰胆碱酯酶为同源四聚体,相对分子量为340 kDa,相对分子量较大,不利于酵母分泌表达,因此将构建丁酰胆碱酯酶单体表达载体。根据四聚体是通过丁酰胆碱酯酶碳端40个氨基酸相连,利用PCR技术构建C端截短型的丁酰胆碱酯酶(BCheC),将BCheC构建到到达载体中,野生型酵母X33表达BCheC的培养上清经SDS-PAGE电泳分析,电泳图中观察不到目的蛋白的表达。通过胆碱酯酶比色法分析,培养上清中有丁酰胆碱酯酶活性,但与稀释40倍的小鼠血清相比,活性较低。丁酰胆碱酯酶单体的半衰期远短于四聚体,为了延长其半衰期,将截短型的丁酰胆碱酯酶与HSA融合(BcheB-HSA),诱导串联表达,培养上清的SDS-PAGE电泳观察不到有目的蛋白的表达,通过胆碱酯酶比色法证明培养上清有丁酰胆碱酯酶的活性,但与稀释40倍的小鼠血清相比,活性较低。由于四聚体结构的丁酰胆碱酯酶最为稳定,通过向培养基添加多聚脯氨酸(poly-proline, polyP),能促进培养基中的单体和二聚体形成四聚体。考虑到polyP分子较小,容易降解,采用polyP融合HSA与BChe共表达得设计方案。将多聚脯氨酸-白蛋白基因和丁酰胆碱酯酶基因装入同一表达载体,利用野生酵母X33诱导共表达培养,培养上清的SDS-PAGE电泳图中观察不到目的蛋白的表达,胆碱酯酶比色法分析,培养上清中有丁酰胆碱酯酶活性,但与稀释40倍的小鼠血清相比,活性较低。5.融合白蛋白的丁酰胆碱酯酶在糖基工程酵母中的表达纯化由于HSA融合的截短型丁酰胆碱酯酶(BCheB-HSA)的蛋白分子量小于四聚体丁酰胆碱酯酶的蛋白分子量,半衰期长于单体丁酰胆碱酯酶(BCheC)。而且通过野生酵母X33的表达结果说明,BCheB-HSA的表达量和酶活与处于同一水平,因此选择BCheB-HSA基因转化到糖基工程酵母中表达和纯化,经过两步阳离子层析纯化,SDS-PAGE可观察到目的条带,Western Blot表明纯化得到目的蛋白,但目的蛋白已发生降解。胆碱酯酶比色法测酶活表明,纯化后的样品酶活性约为小鼠血清的四分之一,而且随着样品的稀释,吸光值也随之下低,表现出明显的剂量依赖性。X33表达BCheB-HSA的培养上清经同样的两步阳离子层析纯化后,Western Blot检测纯化样品中含有HSA,无BCheB-HSA融合蛋白。本实验基于糖基工程酵母表达外源糖蛋白-凝血酶原2和丁酰胆碱酯酶,纯化并经酶活分析,证明糖基工程酵母可表达具有活性的外源糖蛋白。(本文来源于《安徽大学》期刊2016-03-01）
任智文,杨伟[3]（2008）在《凝血酶原法检测重组人脑利钠肽制剂中凝血酶的残留量》一文中研究指出目的了解重组人脑利钠肽(rhBNP)制剂中凝血酶残留量是否符合产品制剂的安全性要求。方法根据凝血酶的生物学活性建立rhBNP冻干制剂中凝血酶残留量的检测方法,并进行凝血酶活性单位检测,计算每瓶rhBNP产品中凝血酶的残留量。结果叁批原液样品的测定均未见凝集现象(>4分钟)。结论rhBNP样品凝血酶的活性单位低于0.5 U,符合产品制剂的安全性要求。(本文来源于《西部医学》期刊2008年04期）
赵邑,赵峰梅,齐延红,卢晓霞,潘薇薇[4]（2006）在《人重组组织因子制备凝血酶原时间测定试剂的研究》一文中研究指出凝血酶原时间(PT)测定是定量检测外源性凝血因子缺陷和监控抗凝治疗的重要指标, 在临床上用于术前筛查病人的出凝血机能是否正常,进行血栓形成预测,出血疾病的诊断等． PT测定是指在37℃下,有Ca2+存在时,凝血活酶与血浆中的蛋白反应,激活凝血因子Ⅶ,进而形成纤维蛋白,记录血浆凝固的时间。在PT测定试剂中最主要的活性成分是凝血活酶即组织因子脂化物,它影响着PT测定的关键指标——国际敏感指数(ISi)值。目前PT(本文来源于《2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集》期刊2006-10-01）
陈建梁,关怡新,崔志芳,姚善泾[5]（2005）在《稀释复性法体外复性重组牛凝血酶原-2包涵体》一文中研究指出对重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折迭复性进行了研究。凝血酶原-2是α-凝血酶生成过程中的一个最小的单链中间前体。重组牛凝血酶原-2在E.coli中高效表达并形成包涵体,经2.5mol?L?1脲和0.7%Triton X-100洗涤,再用8mol?L?1脲和0.3mol?L?1DTT溶解后,得到了包涵体裂解液。研究优化了体外复性溶液,其组成为含2.7mol?L?1脲、0.6mmol?L?1GSSG、GSSG/GSH0.9、0.1%PEG6000和0.5mol?L?1L-Arg、pH7.4Na3PO4缓冲液。牛凝血酶原-2复性后经透析,再被Echis Carinatus Snake Venom激活,转化为有活性的α-凝血酶,其总活力可达2948U?mL?1。结果表明稀释复性法可用于重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折迭复性。(本文来源于《高校化学工程学报》期刊2005年02期）
陈建梁,关怡新,崔志芳,姚善泾[6]（2005）在《重组牛凝血酶原-2在大肠杆菌中的表达及包涵体的制备》一文中研究指出将含凝血酶原-2的质粒成功地转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导培养,获得凝血酶原-2包涵体.经对培养基成分及操作条件进行优化,详细考察了碳源、氮源、无机盐、诱导起始时间、诱导剂添加量、接种量、发酵温度和转速等因素对目标蛋白表达量的影响.在优化的条件下,重组凝血酶原-2包涵体的产量为110mg/L发酵液,占菌体总蛋白的21.7%.(本文来源于《浙江大学学报(农业与生命科学版)》期刊2005年01期）
陈建梁[7]（2005）在《重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折迭复性研究》一文中研究指出凝血酶是目前应用最为广泛的一种止血剂,在临床上有非常重要的用途。凝血酶原-2(pThr-2) 是α-凝血酶生成过程中的分子量最小的单链中间前体,经激活后可转化为有活性的α-凝血酶。本论文通过将含凝血酶原-2基因的质粒克隆至大肠杆菌中并得到大量表达,但这样获得的凝血酶原为包涵体形式,必须经过体外复性后,再激活为凝血酶。本文在优化发酵条件获得高产量的重组牛凝血酶原-2包涵体的基础上,对牛凝血酶原-2的体外重折迭复性如稀释复性以及温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPA)凝胶和二硫键异构酶(DsbA)介导的复性进行了详细的研究。将携带已克隆pThr-2基因的质粒成功地转化到大肠杆菌BL21(DE3) 中,经IPTG诱导后继续培养,获得凝血酶原-2包涵体。对培养基组成及操作条件进行了优化,详细考察了碳源、氮源、无机盐、诱导起始时间、诱导剂添加量、接种量、发酵温度和转速等因素对目标蛋白表达量的影响。最终在优化的培养条件下,重组凝血酶原-2包涵体的产量为110 mg/L发酵液,占菌体总蛋白的21. 7%。将收集的菌体用超声波破碎后,离心得到pThr-2包涵体,然后Tris-HCl缓冲液洗涤包涵体,并优化了洗涤液组成。包涵体用8 M尿素(含0. 3 M DTT)溶解后,在单因素实验的基础上,采用一次回归正交试验及快速登高试验,综合考察了pThr-2包涵体稀释复性过程的关键参数,包括GSSG浓度、GSSG/GSH比例、尿素浓度、PEG6000浓度、L-Arg添加量以及复性温度等。凝血酶活力用生色底物法测定,结果在优化条件下凝血酶活力可达2948U/mL。在稀释复性的基础上,进一步考察了添加温敏型PNIPA凝胶和DsbA协助凝血酶原-2体外复性的效果。实验结果表明,加入凝胶协助复性后凝血酶活力可达6222 U/mL,凝胶的最佳添加量为105 mg/mL,且复性初始蛋白浓度越高,凝胶协助复性的效果就越明显;但PNIPA凝胶的加入在协助复性的同时,也在一定程度上延长了复性达到平衡所需的时间。我们将含有DsbA基因的pAVD63质粒转化到大肠杆菌中,并在优化的培养条件下发酵制备DsbA,经离子交换层析获得的高纯度DsbA用于协助pThr-2复性。由实验结果看出,添加DsbA能够显着改善凝血酶原-2的复性效果,当DsbA与pThr-2的摩尔比为4:1时,凝血酶活力相对稀释复性提高了41. 7%。凝血酶经肝素亲和柱纯化后,荧光光谱分析表明复性后经激活得到的凝血酶具有与天然态凝血酶相同的最大荧光发射波长,表明凝血酶原-2已正确折迭。(本文来源于《浙江大学》期刊2005-01-01）
崔志芳,关怡新,姚善泾[8]（2004）在《聚N-异丙基丙烯酰胺温敏型凝胶协助重组小牛凝血酶原-2包涵体复性的研究》一文中研究指出凝血酶原作为凝血因子的一种,临床上可用于补充凝血因子的缺乏、促进血液凝固,激活后可用于外科手术中的止血剂,主要治疗乙型血友病(先天性IX缺乏)及严重肝脏疾病,是常用的促凝血药。从人或动物中提取的凝血酶原往往受到原材料的限制,同时还会引起人的免疫应答。近年来研究者们尝试用E.coli表达小牛凝血酶原-2(pThr-2),但是得到的pThr-2是以包涵体形式存在的,并且复性收率较低,因此开(本文来源于《第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)》期刊2004-11-01）
刘秀文,刘秀文,宋海峰,汤仲明,赵凯[9]（2002）在《猕猴静脉给予重组水蛭素变异体-2的药代动力学和部分促凝血酶原时间(英文)》一文中研究指出目的:研究猕猴单次和多次(7天)静脉推注加滴注(剂量比为 1:1)新型重组水蛭素变异体-2(rHV-2)的药代动力学和部分促凝血酶原时间(KPTT)变化.方法:交叉设计比较单次1,3和6 mg·kg~(-1)及多次3mg·kg~(-1)注射后血浆rHV-2浓度及KPTT.ELISA法测定血浆rHV-2.结果:浓度曲线形状和水平与推注量及滴注速率相关.推注后 C_(max)分别为 2.90,9.78和15.68 mg·L~(-1),随后分别稳定在0.73-0.86,1.94-2.04和5.41-5.59 mg·L~(-1),剂量间血浆rHV-2浓度有统计差别.AUC随剂量呈线性增大,剂量间清除率和各时间常数无统计差别.各剂量组KPTT比基线值明显延长,随剂量增加有延长趋势.结论:推注剂量和滴注速率对控制rHV-2水平起重要作用,这对临床试验优化给药方案有一定作用.(本文来源于《Acta Pharmacologica Sinica》期刊2002年09期）
赵伏义,张国强[10]（1999）在《重组组织型纤溶酶原激活剂对机体凝血酶原时间和纤维蛋白含量的影响》一文中研究指出我们应用重组组织型纤溶酶原激活剂（ｒｔＰＡ）治疗下肢深静脉血栓形成患者１２例，并对其凝血酶原时间（ＰＴ）及纤维蛋白含量（ＦＩＢ）进行检测，以了解该激活剂对二者的影响。１对象与方法１．１研究对象本组１２例患者，男９例，女３例，年龄３３～７７岁，平均５...(本文来源于《中国普外基础与临床杂志》期刊1999年04期）
重组牛凝血酶原论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
随着基因工程技术的快速发展、蛋白质药物需求量的递增,各种蛋白药物表达平台相继面世,毕赤酵母作为一种最简单的真核表达系统越来越受到人们的重视。但野生酵母分泌的糖蛋白存在过甘露糖修饰的问题,存在较强的免疫原性,限制了该系统的发展和应用。本实验室前期已经成功敲除了毕赤酵母过度甘露糖修饰的相关基因,阻断了毕赤酵母的表达蛋白的高甘露糖基化,然后将复杂型糖基修饰的相关基因整合到毕赤酵母基因组上,获得能够合成哺乳动物复杂糖型的糖基工程酵母,成功用于蛋白质药物的表达制备。凝血酶(α-thrombin)是参与凝血过程中的重要蛋白酶,被广泛用于临床救治。丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase, BChe)可水解丁酰胆碱和可卡因,防止因神经递质积累而引起神经中毒,还能特异性地结合有机磷毒剂和农药,预防和治疗有机磷中毒。目前凝血酶和丁酰胆碱酯酶的主要来源,是从哺乳动物和人类的血制品中提取制备。但是这种生产方法受到环境和血源的制约,产量难以满足不了临床需求。糖基工程酵母兼具酵母的快速、高效表达和哺乳动物细胞的复杂型糖基修饰能力,本实验基于实验室构建的糖基工程酵母表达平台,表达重组人凝血酶原2和丁酰胆碱酯酶两种糖蛋白,探索糖基工程酵母在表达外源糖蛋白方面的应用前景。1.糖基工程酵母表达凝血酶原2的研究合成凝血酶原2的基因,构建至毕赤酵母表达载体中,转化筛选重组工程酵母菌,诱导表达培养,培养上清经SPFF和Unisp两步阳离子层析纯化,SDS-PAGE电泳图中得到37 kDa的目的条带。纯化样品经PNGaseF酶切处理,SDS-PAGE电泳图中去除糖链的蛋白分子量为35 kDa,与理论大小一致。肽图分析的结果进一步证明纯化得到的糖蛋白为凝血酶原2。2.毕赤酵母和哺乳动物细胞293T表达Ecarin的研究在体外,凝血酶原激活剂Ecarin可以将凝血酶原活化为凝血酶。为了得到活化的凝血酶,我们在毕赤酵母和293T细胞中开展了表达Ecarin的研究。全基因合成Ecarin序列,构建至毕赤酵母表达载体中,在毕赤酵母表达系统中,尝试了胞内表达和分泌表达的两种形式,均未获得有活性的Ecarin, Western Blot也未检测到特异性条带。哺乳动物293T细胞瞬时表达Ecarin,收集培养上清,加入293T细胞表达的Ecarin培养上清的凝血酶原2,将S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl)降解为pNA,产生淡黄色颜色反应；未加Ecarin培养上清的的凝血酶原2与S-2238没有颜色变化,表明哺乳动物293T细胞表达的Ecarin可以将糖基工程酵母表达的凝血酶原2活化为有活性的凝血酶。3.凝血酶原-2的活性研究利用发色底物吸光值的变化测Ecarin舌化凝血酶原2的剂量关系,发现当纯化的凝血酶原2的量不变时,随着293T表达Ecarin培养上清的增加,S-2238被降解产生的吸光值也相应的增加,说明Ecarin对prethrombin-2的活化具有剂量依赖性。纯化的凝血酶原2经Ecarin舌化后,可以促进小鼠血浆发生凝集,凝血时间为16s,以TT试剂盒中的凝血酶作为阳性对照,它与血浆反应的凝血时间为27s,说明凝血酶原2活化后具有血凝活性。4.野生型酵母表达不同形式的丁酰胆碱酯酶本实验利用糖基工程酵母表达制备重组人丁酰胆碱酯酶。在野生型酵母X33中表达不同结构的丁酰胆碱酯酶,比较不同结构的丁酰胆碱酯酶的表达量和活性差异,选取长效的丁酰胆碱酯酶用于糖基工程酵母的表达和酶活研究。全基因合成丁酰胆碱酯酶基因,构建毕赤酵母表达载体,并转化到野生型酵母X33中诱导表达培养,收集的培养上清经SDS-PAGE电泳分析,电泳图中观察不到目的蛋白条带。通过胆碱酯酶比色法测酶活,发现表达BChe勺培养上清可降解特异性底物碘化硫代丁酰胆碱(BSCh),与显色剂DTNB发生颜色反应,检测到吸光值变化。与稀释40倍的小鼠血清比较,只有后者酶活的80%左右,说明表达量较低。利用野生型酵母X33尝试表达丁酰胆碱酯酶单体的研究。天然的丁酰胆碱酯酶为同源四聚体,相对分子量为340 kDa,相对分子量较大,不利于酵母分泌表达,因此将构建丁酰胆碱酯酶单体表达载体。根据四聚体是通过丁酰胆碱酯酶碳端40个氨基酸相连,利用PCR技术构建C端截短型的丁酰胆碱酯酶(BCheC),将BCheC构建到到达载体中,野生型酵母X33表达BCheC的培养上清经SDS-PAGE电泳分析,电泳图中观察不到目的蛋白的表达。通过胆碱酯酶比色法分析,培养上清中有丁酰胆碱酯酶活性,但与稀释40倍的小鼠血清相比,活性较低。丁酰胆碱酯酶单体的半衰期远短于四聚体,为了延长其半衰期,将截短型的丁酰胆碱酯酶与HSA融合(BcheB-HSA),诱导串联表达,培养上清的SDS-PAGE电泳观察不到有目的蛋白的表达,通过胆碱酯酶比色法证明培养上清有丁酰胆碱酯酶的活性,但与稀释40倍的小鼠血清相比,活性较低。由于四聚体结构的丁酰胆碱酯酶最为稳定,通过向培养基添加多聚脯氨酸(poly-proline, polyP),能促进培养基中的单体和二聚体形成四聚体。考虑到polyP分子较小,容易降解,采用polyP融合HSA与BChe共表达得设计方案。将多聚脯氨酸-白蛋白基因和丁酰胆碱酯酶基因装入同一表达载体,利用野生酵母X33诱导共表达培养,培养上清的SDS-PAGE电泳图中观察不到目的蛋白的表达,胆碱酯酶比色法分析,培养上清中有丁酰胆碱酯酶活性,但与稀释40倍的小鼠血清相比,活性较低。5.融合白蛋白的丁酰胆碱酯酶在糖基工程酵母中的表达纯化由于HSA融合的截短型丁酰胆碱酯酶(BCheB-HSA)的蛋白分子量小于四聚体丁酰胆碱酯酶的蛋白分子量,半衰期长于单体丁酰胆碱酯酶(BCheC)。而且通过野生酵母X33的表达结果说明,BCheB-HSA的表达量和酶活与处于同一水平,因此选择BCheB-HSA基因转化到糖基工程酵母中表达和纯化,经过两步阳离子层析纯化,SDS-PAGE可观察到目的条带,Western Blot表明纯化得到目的蛋白,但目的蛋白已发生降解。胆碱酯酶比色法测酶活表明,纯化后的样品酶活性约为小鼠血清的四分之一,而且随着样品的稀释,吸光值也随之下低,表现出明显的剂量依赖性。X33表达BCheB-HSA的培养上清经同样的两步阳离子层析纯化后,Western Blot检测纯化样品中含有HSA,无BCheB-HSA融合蛋白。本实验基于糖基工程酵母表达外源糖蛋白-凝血酶原2和丁酰胆碱酯酶,纯化并经酶活分析,证明糖基工程酵母可表达具有活性的外源糖蛋白。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
重组牛凝血酶原论文参考文献
[1].樊宇,唱韶红,巩新,刘波,吴军.毕赤酵母表达重组人凝血酶原2及活性分析[J].军事医学.2016
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[4].赵邑,赵峰梅,齐延红,卢晓霞,潘薇薇.人重组组织因子制备凝血酶原时间测定试剂的研究[C].2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集.2006
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