基于基因组学及蛋白酶特性的瑞士乳杆菌差异性分析

论文摘要

瑞士乳杆菌是广泛应用于发酵乳制品生产的一种乳酸菌。在众多的乳酸菌中,瑞士乳杆菌因其优良的蛋白水解能力而受到关注。研究表明瑞士乳杆菌的蛋白水解特性存在差异性,但是瑞士乳杆菌的基因型与表型之间的相关性仍有待进一步研究。本文以中国四川、云南、青海等地区采集的曲拉、发酵牦牛乳、乳扇、泡菜等传统发酵食品及粪便样品为对象,对样品中的瑞士乳杆菌进行分离、纯化、鉴定和保藏。对分离出的38株瑞士乳杆菌进行基因草图测序,同时结合NCBI公布全基因组测序的12株瑞士乳杆菌基因序列进行包括核心基因与泛基因分析、功能注释等比较基因组学的研究,结果表明瑞士乳杆菌的基因组具有差异性,菌株具有794个同源基因,各自含有6196个特有基因。基于同源基因的系统发育树构建,发现瑞士乳杆菌存在地区聚类的趋势,青海西宁与四川阿坝的菌株明显聚集在不同的进化分支。此外,瑞士乳杆菌的泛基因呈现开放型,仍存在基因水平转移的可能。同源蛋白簇（COG）功能注释结果表明不同瑞士乳杆菌的氨基酸转运与代谢的基因数量存在较大差异。对瑞士乳杆菌蛋白水解基因的预测结果表明菌株编码胞壁蛋白酶（CEP）的基因存在很大差异,而编码肽酶的基因差异性不大。依据基因组学的分析结果,选择30株瑞士乳杆菌测定CEP、三种氨基酸肽酶（PepN、PepX、PepC）以及芳族转氨酶（AraT）活性,同时测定了菌株在MRS和脱脂乳培养基中的产酸能力。蛋白水解酶活性结果表明,菌株之间存在显著差异,尤其是泡菜来源的菌株V-GZTR-132-M1的CEP活性显著低于其他菌株,粪便来源的菌株FSDJN10M6胞内氨基酸肽酶和AraT活性显著低于其他菌株。结合基因组结果分析,瑞士乳杆菌的CEP活性与PrtH3基因有关。同时,相关性分析和主成分分析（PCA）结果表明瑞士乳杆菌的三种氨基酸肽酶活性呈显著正相关,CEP活性与PepN、PepC、AraT活性以及脱脂乳培养基中的pH变化量也存在正相关关系。此外,由CEP活性及PCA结果可以发现青海西宁和四川阿坝的瑞士乳杆菌也存在地区聚类的现象。选取蛋白酶活性高、中、低的瑞士乳杆菌DQHXN08M33、DQHXN-32M42、DSCAB11L3、V-GZTR-132-M1作为研究对象与对照菌ATCC15009同时进行脱脂乳发酵实验,结果表明瑞士乳杆菌菌株之间的CEP、三种氨基酸肽酶和AraT活性,以及脱脂乳中蛋白质与肽分子量分布、pH值、乳糖、半乳糖、葡萄糖、乳酸和乙酸含量存在差异性。相关性分析结果表明发酵过程中5株瑞士乳杆菌的蛋白质与多肽分子量分布、pH值、乳糖消耗量、半乳糖与乳酸产量呈显著正相关关系。综上所述,瑞士乳杆菌菌株之间在蛋白水解代谢通路上存在基因型和表型的差异性,同时二者之间存在一定的联系,即菌株的CEP活性及其在脱脂乳中的产酸能力与PrtH3基因有关。瑞士乳杆菌在脱脂乳发酵过程中的产酸能力不仅受碳水化合物利用的影响,还与菌株蛋白水解相关酶活性有关,本课题为瑞士乳杆菌的开发和应用提供了一定的理论支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 瑞士乳杆菌概述
•   1.2 瑞士乳杆菌的比较基因组学概述
•   1.3 瑞士乳杆菌的蛋白水解相关酶概述
•     1.3.1 胞壁蛋白酶
•     1.3.2 肽转运蛋白
•     1.3.3 胞内肽酶
•     1.3.4 芳族转氨酶
•   1.4 研究背景及意义
•   1.5 主要研究内容
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料与试剂
•     2.1.1 实验样品
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验菌株
•     2.1.4 培养基
•   2.2 主要仪器与设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 瑞士乳杆菌的分离、纯化与鉴定
•     2.3.2 瑞士乳杆菌的基因组草图测序及分析方法
•     2.3.3 瑞士乳杆菌MRS培养基中蛋白酶活性的测定
•     2.3.4 瑞士乳杆菌发酵过程中指标的测定
•   2.4 数据处理与分析方法
• 3 结果与讨论
•   3.1 瑞士乳杆菌的分离、纯化与鉴定结果
•   3.2 瑞士乳杆菌的基因组分析
•     3.2.1 编码基因分析
•     3.2.2 非编码RNA分析
•     3.2.3 比较基因组学分析
•   3.3 瑞士乳杆菌的蛋白酶活特性及生长特性
•     3.3.1 胞壁蛋白酶的活性分析
•     3.3.2 胞内三种氨基酸肽酶的活性分析
•     3.3.3 胞内芳族转氨酶的活性分析
•     3.3.4 MRS和脱脂乳培养基中的生长及产酸特性分析
•     3.3.5 蛋白酶活性与产酸特性的相关性分析
•   3.4 瑞士乳杆菌在脱脂乳发酵过程中蛋白酶及发酵特性的变化
•     3.4.1 生长能力分析
•     3.4.2 胞壁蛋白酶的活性变化分析
•     3.4.3 胞内三种氨基酸肽酶的活性变化分析
•     3.4.4 胞内芳族转氨酶的活性变化分析
•     3.4.5 蛋白质及肽分子量的变化分析
•     3.4.6 产酸能力分析
•     3.4.7 糖和有机酸含量的变化分析
•     3.4.8 凝乳能力分析
•     3.4.9 指标的相关性分析
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1:作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录2:瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶基因表
• 附录3:瑞士乳杆菌肽转运系统基因表
• 附录4:瑞士乳杆菌肽酶基因表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 亓燕然

导师: 刘小鸣

关键词: 瑞士乳杆菌,比较基因组学,蛋白水解,发酵,多样性

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 江南大学

分类号: Q78;TS252.1

总页数: 66

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