asb11基因对P19细胞向心肌细胞分化的影响

论文摘要

在胚胎发育过程中,心脏是最早形成的结构之一。阐明心脏发生过程中心肌细胞分化的基因调控机制对治疗心脏疾病有重要的理论指导意义。ASB11属于ASB家族（全名为含锚蛋白重复序列和细胞因子信号抑制物盒蛋白质家族）。该家族的N端含有锚蛋白重复结构序列,C端具有SOCS盒结构。小鼠asb11基因（m-asb11,Gene ID:NC000086.7）定位于X染色体上,由9个外显子构成。m-asb11基因的cDNA全长1462 bp,编码323个氨基酸。m-asb11在成体心脏以及成体生殖脂肪垫中大量表达,参与生物体的生长发育以及新陈代谢等多种生命过程。但目前对m-asb11在心脏发育中的作用尚无研究报道。因此,本论文利用P19细胞研究m-asb11基因对P19细胞向心肌细胞分化的影响。P19细胞是从C3H/He小鼠畸胎瘤中分离建立起来的一种胚胎瘤细胞。P19细胞作为一种多能干细胞,具有干细胞分化潜能,也能快速增殖。P19细胞可以在含有0.5%-1.0%浓度的DMSO的培养环境下分化形成心肌细胞,同时在合适浓度的维甲酸的存在下诱导形成神经和神经胶质样细胞。但在DMSO和维甲酸的共同存在下,只会分化成神经和神经胶质细胞。本文首先用小鼠心脏组织提取了总RNA,利用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA,建立了小鼠cDNA文库。以cDNA为模版利用PCR技术扩增出长度为1042 bp的m-asb11基因。进一步将扩增的m-asb11基因片段连接到T-载体上,经Bam HI和XhoI酶切消化,琼脂糖分离获得纯化的m-asb11基因片段,连接到pCMV-Tag2B载体上,构建成m-asb11基因表达质粒。同时,用1.0%DMSO诱导P19细胞向心肌细胞分化,通过RT-PCR、免疫印迹以及细胞免疫荧光对诱导结果进行了检测。RT-PCR结果显示nkx2.5在诱导组有RNA表达。免疫印迹结果显示诱导细胞的心肌特异蛋白肌钙蛋白T（CTNT）以及GATA4蛋白呈从无到有的表达模式。肌球蛋白重链蛋白MF20抗体免疫荧光显示诱导组细胞表达肌球蛋白重链蛋白。这些结果说明模型建立成功。本文进一步利用该心肌细胞分化模型研究m-asb11基因对P19细胞向心肌细胞分化过程的影响。在P19细胞悬浮培养前转染m-asb11基因表达质粒,悬浮诱导4 d后,将诱导后细胞贴壁培养,分别收集培养8 d和13 d的细胞提取总蛋白,采用免疫印迹技术（western blot）进行GATA4和CTNT的蛋白表达分析。免疫印迹分析结果显示,m-asb11过表达组中GATA4和CTNT的表达显著低于诱导组,提示m-asb11可能抑制P19细胞向心肌细胞的分化过程。同时,在培养7 d时取少量细胞爬片贴壁后进行MF20抗体的免疫荧光。免疫荧光结果表明,相较于对照组,m-asb11过表达组的细胞的荧光有所降低。该结果支持m-asb11可能抑制P19细胞向心肌细胞的分化过程的结论。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
•   1.1 泛素化与蛋白降解
•   1.2 ASB蛋白家族概论
•     1.2.1 ASB家族的结构
•     1.2.2 ASB与肿瘤发生的关系
•     1.2.3 ASB与造血分化的关系
•     1.2.4 ASB与细胞能量代谢的关系
•     1.2.5 ASB11 当前研究进展
•   1.3 小鼠心脏发育的过程
•   1.4 心脏发育的相关基因调控
•   1.5 心肌细胞分化过程的基因调控
•   1.6 P19 细胞诱导心肌分化模型
•   1.7 本文研究意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验试剂
•     2.1.2 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 小鼠cDNA文库的构建
•       2.2.1.1 小鼠心脏组织取材
•       2.2.1.2 小鼠心脏组织提RNA
•       2.2.1.3 RNA反转录
•     2.2.2 m-asb11 表达载体的构建
•       2.2.2.1 扩增目的片段引物的设计与合成
•       2.2.2.2 连接子的转化
•       2.2.2.3 阳性克隆的筛选
•     2.2.3 细胞培养
•       2.2.3.1 细胞复苏
•       2.2.3.2 细胞传代
•       2.2.3.3 细胞冻存
•       2.2.3.4 细胞转染
•       2.2.3.5 细胞诱导分化
•       2.2.3.6 细胞总蛋白提取
•     2.2.4 蛋白质印迹法检测P19 细胞蛋白表达量
•     2.2.5 RT-PCR
•     2.2.6 细胞免疫荧光
•   2.3 生物信息学分析的主要软件与数据库
• 第三章 实验结果及分析
•   3.1 pCMV-Tag2B-asb11 过表达载体的构建
•   3.2 P19 通过DMSO诱导分化形成心肌细胞的模型建立
•     3.2.1 拟胚体的产生
•     3.2.2 利用RT-PCR对分化模型nkx2.5的RNA表达进行分析
•     3.2.3 利用免疫印迹实验对分化模型的蛋白表达进行分析
•     3.2.4 利用细胞免疫荧光检测细胞中的MF20 表达
•   3.3 m-asb11 对细胞模型分化过程的影响
•     3.3.1 pCMV-Tag2B-asb11 转染效率的验证
•     3.3.2 细胞聚集体统计
•     3.3.3 利用RT-PCR验证nkx2.5的RNA表达
•     3.3.4 利用免疫印迹实验检测心肌标记因子CTNT和 GATA4 的表达
•     3.3.5 利用细胞免疫荧光检测细胞中的MF20 表达
• 讨论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王璐

导师: 吴秀山,范雄伟

关键词: 细胞,心肌分化,免疫印迹,免疫荧光

来源: 湖南师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 湖南师范大学

分类号: R329.2

总页数: 58

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