论文摘要
自1929年英国生物学家弗莱明发现青霉素至今,人类已不断研发出多种抗生素。目前也已开展了各种抗生素在临床上得应用,越来越多的感染患者得到治愈,同时也伴随着越来越多的病原菌对各类抗生素产生了强大的耐药性。这其中以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）为代表的多重耐药菌严重影响人类及其它生物健康。发现并研究新型药物以对抗多重耐药菌已成为当今生命科学研究领域的重要问题之一。本文以经典模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans,C eegans）为实验研究对象,基于数据库信息高通量筛选研究了迄今为止Brevinin-2家族85种多肽特性及其对MRSA抑菌活性。同时,从行为水平、生殖发育、遗传变异、生理生化、基因转录、蛋白表达、作用机理等多个水平层面系统地研究。发现了 Brevinin-2家族典型抗菌肽对秀丽隐杆线虫MRSA感染模型的治疗作用、抑制MRSA的毒力作用及激活秀丽隐杆线虫DAF-2/DAF-16先天免疫调控通路的重要作用。本研究对新型抗菌药物筛选、评价、作用机制及临床研发具有重要意义。主要研究结果如下:1.Brevinin-2家族典型抗菌肽对MRSA具有较好的活性及自身特性通过抗菌肽大数据、生物信息学分析及抑菌活性高通量筛选,发现Brevinin-2家族各抗菌肽的MRSA体外抗菌活性差异极大,33种抗菌肽MIC范围从4.9～135.5 μM,MBC范围从23.4～>500 μM。均具有抗MRSA活性。经过稳定性、溶血率、细胞毒性等进一步筛选后,发现了 Brevinin-2、Brevinin-2DYc/2RNa、Brevinin-2HS2、Brevinin-2ISb、Brevinin-2LF2、Brevinin-2-OA3、Brevinin-2-OR5、Brevinin-2-OW2、Brevinin-2RE1、Brevinin-2-related、Brevinin-2SKa、Brevinin-2TP1 和 Brevinin-2TSa的13种显示出较好自身特性的多肽。其中多种抗菌肽MIC<10μM,即有效浓度极低,是迄今为止抗菌多肽所发现的最低MIC浓度的抗菌肽家族。但实验过程中也发现,现有的Brevinin-2家族中,52种抗菌肽对MRSA抑制活性较低或无抑制活性,其在系统进化中也展现出较为相近的进化距离。往往两种氨基酸序列差异较小的Brevinin-2多肽。其抑菌活性也有着较大的差异。2.MRSA对秀丽隐杆线虫具有明显毒性作用利用MRSA对多品系秀丽隐杆线虫行为、发育、生殖、生存、遗传等多个水平开展研究,发现MRSA对秀丽隐杆线虫各水平生理状态均有着较为显著的影响。发现MRSA显著降低秀丽隐杆线虫各项运动指标（除向后运动频率）;显著降低秀丽隐杆线虫成虫生长,即体长（0.687±0.024,Control:0.988±0.008）;显著降低秀丽隐杆线虫产卵量（257±0.024,Control:355.7±15.2）;对秀丽隐杆线虫产生显著致死效应,处理时间96h的MRSA处理组线虫全部死亡;发现Cep-1、Ced-3、Daf-2、Daf-16、Pmk-1和Skn-1六个基因在线虫体内主要扮演对抗MRSA感染的功能;同时通过彗星电泳实验证明,MRSA对秀丽隐杆线虫具有较强遗传毒性。上述结果的获得一方面证实了模式生物秀丽隐杆线虫由于其各方面特性,适合作为MRSA感染的研究对象。另一方面从多个角度和水平证实了以MRSA为代表的病原微生物对秀丽隐杆线虫产生的较强毒性作用（常规实验仅在致死率实验中研究外源物质对虫体的影响）。3.Brevinin-2家族典型抗菌肽可有效治疗MRSA感染秀丽隐杆线虫在治疗实验研究中为了获取更为准确的治疗数据,一方面我们构建了秀丽隐杆线虫MRSA感染模型,使用各类典型抗菌肽治疗感染模型线虫;另一方面我们直接将健康的秀丽隐杆线虫成虫养殖在培养有MRSA的平板上持续感染96 h,同时加入抗菌肽治疗。另外在具有治疗潜力抗菌肽的筛选标准上我们也构建了更为严苛的新型评价体系:使用病原微生物敏感型秀丽隐杆线虫代替对病原微生物承受力更强N2野生型;实验组在96 h后治疗存活率较阳性感染对照组具有显著差异的同时必须满足存活率>60%且同时间阳性感染组存活率<20%才认定为具有较好治疗效果。在上述近乎严苛的筛选条件下我们发现了 4种治疗效果较佳的抗菌肽:Brevinin-2,Brevinin-2-OA3,Brevinin-2ISb和Brevinin-2TSa。在随后的低浓度感染治疗实验中发现了 1/2 MIC 的 Brevinin-2-OA3,1/4MIC 的 Brevinin-2ISb 和 1/2 MIC 的 Brevinin-2TSa依旧具备较好的治疗活性。同时,在溶血活性实验中最终确定了一种治疗效果好（感染模型96 h存活率90.02%±1.23%;持续感染存活率81.72%±2.62%）、溶血率极低（1/4MIC浓度5.03%±0.35%）、对线虫具有一定益生作用（较对照加速幼虫至成虫发育24.1 h,延长寿命7d）的多肽Brevinin-2ISb。可以说是其在作为备选新药研发中的重要发现,极大程度地加速了 Brevinin-2ISb及其相关抗菌肽临床研发应用,也为本文的整体研究提升了价值和意义。4.Brevinin-2ISb以入胞结合核酸形式抑制MRSA毒力因子表达水平为了探究低剂量Brevinin-2ISb产生有效感染治疗活性的深层次机理,我们开展了相关研究。在研究中发现,低浓度（1/4MIC）Brevinin-2ISb抗菌肽能够在一定时间范围内显著抑制MRSA产生的多种毒力因子活性:经1/4（2.175 μM）浓度的Brevinin-2ISb抗菌肽作用MRSA菌体2小时后相对于MRSA阳性对照组（50.62%）显著降低（17.54%）、4 h后1/4 MIC的Brevinin-2ISb处理组呈现完全凝固状态,抑制了 MRSA血浆凝固酶活性、1/4 MIC的Brevinin-2ISb处理组从12h开始,MRSA总肠毒素量显著降低,到48h总量达到最低;抑制了 MRSA上清刺激淋巴细胞TNF-α释放:1/4 MIC的Brevinin-2ISb在共培养8 h时,抑制MRSA上清刺激淋巴细胞TNF-α释放效果最佳,达到32.38 pg/mL,此后呈现稳定抑制状态;显著抑制了 MRSA毒力基因及蛋白质表达:α-溶血素基因表达水平较对照组显著降低1.96～5.23倍;MRSA血浆凝固酶基因表达水平较对照组显著下调;3 h～4 h表达水平降至最低（5.207倍）;MRSA各类毒素基因表达水平在处理前48h显著降低;Tsst-1、FnbA、FnbB、agrrA等MRSA转录正相关调控基因转录显著低2.23～5.31倍。与此同时伴随着α-溶血素蛋白质、肠毒素A、B、G和TSST-1蛋白质的表达在Brevinin-2ISb作用的前48h受到显著抑制。随后,我们通过Brevinin-2ISb抗菌肽的圆二色谱实验及三级结构预测发现,之所以产生上述抑制的原因是由于其α-螺旋及无规卷曲的特殊结构所致。而这一抑制也通过Brevinin-2ISb荧光定位和凝胶阻滞实验证实了是来自于Brevinin-2ISb抗菌肽跨膜入胞的核酸结合造成的抑制。同时还发现Brevinin-2ISb在与MRSA的DNA结合后改变了其二级结构。Brevinin-2ISb抗菌肽对于MRSA抑制这一重要机制的阐明,对于其后续针对多种多重耐药菌及病原微生物的新药研发,奠定了坚实的研究基础、实验体系模型。5.Brevinin-2ISb激活秀丽隐杆线虫DAF-2/DAF-16先天免疫调控通路为了探究Brevinin-2ISb与秀丽隐杆线虫DAF-2/DAF-16先天免疫调控通路的关系及初步机制机理,我们开展了相关研究。DAF-2/DAF-16通路相关免疫基因在24小时后表现出不同程度的抑制表达。在C29F3.7和K08D8.5基因上调表达24 h后,每个治疗组的表达水平恢复到正常水平,并且没有被MRSA的长期治疗所抑制。主要是因为上述两个基因都是早期表达的基因,而不是DAF-2/DAF-16途径中编码蛋白的具有抗菌活性的基因。然而,在Brevinin-2ISb作用下,Lys-7和Spp-1在48 h内表现出持续的高表达状态,尤其是Lys-7（48 h内上调8-25倍）。由于Lys-7基因表达水平的显著增加,我们通过免疫印迹和激光共聚焦定位证实了我们在蛋白质水平上的创新性进一步验证。通过LYS-7蛋白表达强度的测定,较全面地证实了在低浓度Brevinin-2ISb作用下,DAF-2/DAF-16免疫途径中关键抗菌蛋白的激活（离体免疫印迹实验上调4.37倍～7.22倍;在体荧光蛋白表达上调:2.97倍-4.62倍）。进一步证实了 Brevinin-2ISb在激活DAF-2/DAF-16免疫通路中发挥的重要作用。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 谢晖
导师: 梁继民
关键词: 抗菌肽,家族,秀丽隐杆线虫,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,药物筛选,毒力因子,先天免疫通路
来源: 西安电子科技大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 西安电子科技大学
分类号: Q939.91
DOI: 10.27389/d.cnki.gxadu.2019.003283
总页数: 176
文件大小: 15514k
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标签：抗菌肽论文; 家族论文; 秀丽隐杆线虫论文; 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌论文; 药物筛选论文; 毒力因子论文; 先天免疫通路论文;