CDK9与REV-ERBα形成复合体结合RORE序列调控BMAL1的表达

论文摘要

生物节律,也称为昼夜节律或生物钟,是有机体顺应日夜变化而发生的24小时周期性变化。依据基因组学研究证明,细胞中大约三分之一基因的表达随着昼夜节律的变化而改变,其中大部分的基因都是直接由BMAL1-CLOCK转录复合体调控的。生物节律的分子机制主要通过转录-翻译反馈环来调控,BMAL1和CLOCK结合形成异二聚体,结合到钟控基因启动子中的E-box元上,而启动下游生物钟基因表达,如Cry,Per,Rev-erb和Ror等。其中CRY和PER可以互相结合成异二聚体,反向抑制BMAL1-CLOCK的转录活性,形成转录-翻译负反馈环。RORa或REV-ERBα则是通过竞争性结合Bmal1和Clock基因启动子区域的RORE序列,激活或是抑制Bmal1和Clock的表达,形成负反馈调节。但是目前对于调控生物节律的机制仍知之甚少,我们希望通过高通量化学生物学的方式,发现调控生物节律的化合物,找出靶标基因,并阐明其分子机制。我们发现多种CDK抑制剂能下调关键节律基因Per2的表达,例如LY2857785。LY2857785是一种有效的CDK9抑制剂,对CDK7和CDK8也有一定的抑制效果。通过siRNA验证,发现Cdk9敲低时会明显下调Per2的表达,同时伴随REV-ERBα表达明显升高。通过免疫沉淀（IP）和凝胶迁移（EMSA）实验,发现CDK9与REV-ERBα有直接相互作用,并结合Bmal1基因启动子区域的RORE序列,进而调控生物节律。为了进一步验证CDK9对节律调控的生理意义,我们借由AAV在小鼠下丘脑（或SCN,视交叉上核）中敲低Cdk9,发现小鼠的节律周期从23.99小时延长为25.16小时;而小鼠的活动力,尤其是夜间的运动量明显下降。以上的结果提出CDK9参与生物节律调控的可能性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 中英文缩略词注解
• 第一节 序言
•   1.1 生物节律
•   1.2 生物节律与肿瘤
•   1.3 细胞周期与CDK
•   1.4 参与细胞周期调控的CDK
•   1.5 其他CDKs的生物学功能
•   1.6 细胞周期与生物节律的耦联
• 第二节 实验材料与方法
•   2.1 质粒与质粒构建
•   2.2 细胞株
•   2.3 实验动物
•   2.4 主要仪器、试剂和抗体
•   2.5 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的获得
•   2.7 细胞培养
•   2.8 AAV病毒包装
•   2.9 免疫共沉淀
•   2.10 在不同时间点取小鼠的下丘脑和肝样品
•   2.11 分离细胞核和细胞质
•   2.12 初筛
•   2.13 复筛
•   2.14 实时记录PER2 的表达量
•   2.15 siRNA基因敲低实验
•   2.16 Alarmar Blue检测
•   2.17 凝胶迁移率实验（EMSA）
•   2.18 AAV病毒感染小鼠下丘脑
•   2.19 蛋白质免疫印迹（Western blot）
•   2.20 RNA抽提、cDNA的合成以及real-time PCR
•   2.21 数据统计
• 第三节 实验结果
•   3.1 筛选调控节律的化合物
•   3.2 LY2857785 下调PER2 的表达量,而BS-181 改变PER2 表达的相位
•   3.3 siCdk9 下调PER2 的表达,而si Cdk2,5,7,8 影响不明显
•   3.4 敲低Cdk2,Cdk5,Cdk7,Cdk8和Cdk9 对核心节律基因的影响
•   3.5 CDK9 与 REV-ERBα存在相互作用
•   3.6 CDK9与REV-ERBα共同识别Bmal1 基因启动子区域的RORE序列
•   3.7 CDK9 在小鼠的下丘脑和肝脏中呈昼夜震荡性表达
•   3.8 在小鼠的下丘脑中敲低Cdk9 是否改变小鼠的节律行为
• 第四节 总结与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 欧家丽

导师: 唐芸棋

关键词: 节律

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 上海交通大学

分类号: Q75

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.003677

总页数: 72

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