摘要：目的对西尼地平片微生物限度检查方法适用性试验进行验证。方法采用计数培养基适用性检查，采用平皿法计数方法适用性试验（回收率）、控制菌试验、供试品检查。结果西尼地平片微生物限度检查方法适用性试验符合规定要求。结论 通过适用性试验，表明西尼地平片（规格：5 mg）微生物限度检查采用《中国药典》2015 年版四部平皿法，方法可行。
关键词：西尼地平片；微生物限度；方法适用性
0 引言
西尼地平片[1]是适用于高血压患者的治疗药物。西尼地平片不良反应主要表现在泌尿系统、神经系统、循环系统、消化系统、血液系统、过敏及浮肿、疲倦、血清胆固醇上升等现象。由于会引起血压过低等症状，故高空作业、驾驶机动车及操作机器工作时应禁用。对于一直存在于人类生存环境中的微生物，相信很多的人都不是很了解，毕竟这个东西个体小，不借助仪器是根本不可能发现的，所以对微生物这个东西大家都是听说过，却没有几个人实际看到过实物。那么微生物究竟是一个什么样的存在，对人体的危害有哪些？从药品生产的卫生学而论，微生物对药品原料、生产环境和成品的污染，是造成生产失败、成品不合格，直接或间接对人类造成危害的重要因素。受到污染的药品会引起使用者的感染甚至引起严重后果。受到微生物污染的药品还可能产生化学和物理变化而变质，使药品失效或产生毒害作用。对药品非无菌产品中的微生物进行控制是保证药品安全性的重要措施。微生物限度检查法是各国药典收载的控制非无菌药品中微生物限度的基本检测法，其标准也伴随着科学技术的发展、生产工艺水平的提高、国际贸易的日益增多而逐步修订提高。为了有效控制产品质量，参照《中国药典》2015年版四部非无菌产品微生物限度检查法[2]，通过对西尼地平片微生物限度方法适用性试验的研究，确认该方法简便、快捷、重现性好、结果准确可靠。
根据《中国药典》2015 年版四部非无菌产品微生物限度检查法项下的要求，对西尼地平片（规格：5 mg）进行了微生物限度检查方法适用性试验[3]，现将试验结果总结如下。
1 供试品
西尼地平片，规格：5 mg，批号：1512071、1603071、1603081。
2 检测仪器设备
架盘天平、洁净工作台、数显水浴恒温振荡器、生化培养箱、生物安全柜。
3 菌种、培养基、缓冲液
菌种：CMCC（B）26003 金黄色葡萄球菌、CMCC（B）63501 枯草芽孢杆菌、CMCC（B）10104 铜绿假单胞菌、CMCC（F）98001 白色念珠菌、CMCC（B）44102 大肠埃希菌、CMCC（F）98003 黑曲霉。
7.1.1 菌液制备
4 缓冲液/稀释液及培养基
pH7.0 氯化钠- 蛋白胨缓冲溶液胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基、硫乙醇酸盐流体培养基。
5 方法
《中国药典》2015 年版微生物限度检查法项下的适用性试验。
6 需氧菌、霉菌和酵母菌计数
6.1 菌悬液的制备
取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1 mL 含菌数不大于100 cfu（菌落形成单位）的菌液；取3～5 mL 含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80 的pH7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液加入新鲜培养物的黑曲霉，制成每1 mL 含菌数不大于100 cfu 的菌悬液。
6.2 计数培养基适用性检查
（4）阴性对照组：稀释剂为pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液，无抑菌作用，不予考察。
将铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉不大于100 cfu 的菌液分别至胰酪大豆胨琼脂培养基平板[4]，每株试验菌平行制备2 个平皿，培养温度33.0 ℃，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌培养3 d，黑曲霉、白色念珠菌培养5 d，计数；将黑曲霉、白色念珠菌不大于100 cfu 的菌液接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，每株试验菌平行制备2 个平皿，培养温度23.0 ℃，培养5 d，计数。
6.2.2 对照培养基组
为了考察温度条件对磁化效果的影响，选取试验条件为：Fe2+浓度为0.021 mol/L，氨水浓度为1.0 mol/L，反应时间为8 min，其结果见图4。
用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。计数培养基的适用性检查结果，见表1。结果表明，被检培养基的菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致；对照培养基与被检培养基平均菌落数在62～94 cfu，比值在0.5～2，适用性试验符合规定。
表1 计数培养基的适用性检查结果
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6.3 计数方法适用性试验（平皿法）
6.3.1 供试品溶液的制备
取西尼地平片，用pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液溶解稀释制成1：10 供试液。
6.3.2 接种和稀释
（1）试验组：取1：10 的供试液10 mL，加至无菌空试管中，共5 管，分别加入铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌液0.1 mL，制成菌含量＜100 cfu/mL 的供试液，各自混匀，分别从不同混合溶液取1 mL 置不同的无菌平皿中，平行2 份，注入TSA，置33.0 ℃培养箱中倒置培养3 d。含黑曲霉、白色念珠菌的混合溶液各重复制备一份，加入沙氏葡萄糖琼脂培养基，凝固后，置23.0 ℃培养箱中倒置培养5 d。
（2）供试品对照组：取1：10 的供试液1 mL 注入平皿中，平行制备4 个平皿，其中2 个平皿倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，凝固后，置33.0 ℃培养箱中倒置培养3 d；另外2 个平皿倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，凝固后，置23.0 ℃培养箱中倒置培养5 d。
EM算法主要分为两步:第1步,即E步,根据当前的参数估计值 和数据{Uj,dj},计算关于隐藏变量{yj}的对数似然函数的期望值;第2步,即M步,通过最大化关于参数w的期望函数,更新参数估计值具体过程如下:
（3）菌液对照组：取稀释液10 mL，制备5 份，分别加入枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌液0.1 mL，制成菌含量＜100 cfu/mL 的供试液，各自混匀，分别从不同混合溶液取1 mL 置不同的无菌平皿中，平行2 份，注入TSA，置33.0 ℃培养箱中倒置培养3 d。白色念珠菌的混合液重复制备1 份，加入沙氏葡萄糖琼脂培养基，凝固后，置23.0 ℃培养箱中倒置培养5 d。
6.2.1 被检培养基组
7.2.2 试验方法
每株试验菌每种培养基制备2 个平皿，以算术均值作为计数结果。结果表明，供试品采用平皿法，（试验组菌落数- 供试品对照组菌落数的值）/（菌液对照组菌落数）在0.5～2，各试验菌的回收率试验均符合要求，菌落计数结果见表2。
7 控制菌检查的适用性试验
7.1 大肠埃希菌检查用培养基适用性检查
控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。
识字教学是第一学段语文教学的重点。《义务教育课程标准》提出，一、二年级要认识常用汉字1600个。在与教师的访谈中得知，平均每节语文课要认10—15个生字，大部分学生记得快，忘得也快，尽管在不断巩固，可是一学期下来，教科书生字表（一）要求会认的生字学生并没有全部识记。还有一些学生缺乏兴趣，学习动力不足，有三分之一的生字不认识。在研究前期对我校一年级5班49名学生，二年级4班53名学生进行了问卷调查，发现一年级学生中有35%非常喜欢识字，28%比较喜欢识字，19%不喜欢识字，18%非常不喜欢识字。二年级学生中有30%非常喜欢识字，25%比较喜欢识字，24%不喜欢识字，21%非常不喜欢识字。
表2 菌落计数结果
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国内学者对现金持有的研究已经持续了很久，无论是外部因素还是内部因素都有涉及。因为只有管理层最终能决定企业现金持有策略，所以要想解决由于现金持有不当带来的问题，应该重点挖掘管理层出现错误决策的原因。企业只有制定规范的日常治理制度，才能有效地监督管理层的活动，而董事会的实际办事效率在很大程度上取决于独立董事真正发挥出的日常作用，这也是公司治理制度的关键所在。
（1）情绪管理主要是保障患者拥有良好的心态和稳定的情绪，因为情绪波动太大或者心态消极容易对患者造成不良影响。所以，在对患者进行充分的了解后，要及时的和患者沟通，并掌握沟通技巧。此外，心血管内科患者容易产生紧张焦虑、烦躁不安等情绪，护士应耐心聆听患者提出的问题并给予解答，如果考虑到患者的心理存在变化，应对其进行心理辅导，以保证患者情绪稳定。同时也可以采用科学的疗法进行心理情绪方面的治疗，鼓励患者战胜病魔的信心。
7.1.2 麦康凯液体培养基促生长能力检查
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至10 mL胰酪大豆胨液体培养基中33.0 ℃培养24 h，取此培养液1 mL加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9 mL，采用10 倍递增稀释法，稀释至10-7，使菌数约为50～100 cfu/mL。
取50～100 cfu 的大肠埃希菌菌液于麦康凯液体对照培养基和麦康凯液体培养基中，在33.0 ℃的培养箱中培养≤18 h，比较，被检培养基试验菌生长良好，与对照培养基管基本一致。
7.1.3 麦康凯液体培养基抑制能力检查
单位高度桩侧土拱受力简图，如图4所示。根据基本假设(2)，两单独拱所受推力之和等于桩后滑坡推力，土拱不向桩前土体传递桩后滑坡推力，故不考虑桩前土体提供的反力；与桩后土拱一样，忽略土拱自身产生的剩余下滑力。因此，桩侧土拱在y轴方向上受到桩后土拱向前传递的剩余滑坡推力p2以及桩侧摩阻力Fy2的共同作用。
在未来的几十年里，我们不太可能会遇到有意识机器的反叛，但我们可能不得不面对成群结队的机器人。这些机器人比我们的母亲更懂得如何触发我们的情感，并在人类精英的命令下，利用这种不可思议的能力，试图向我们推销某种东西，无论是汽车、政治家，还是整个意识形态。机器人可能会识别我们最深的恐惧、仇恨和渴望，并利用它们来对付我们。我们已经在近期世界各地的选举和公民投票中领略到了这一点，黑客学会了如何通过分析有关选民的数据并利用他们的偏见来操纵个体选民。虽然科幻惊悚片中的末日伴随着大火和浓烟，但在现实中，我们可能只会面对一个由鼠标点击带来的乏味末日。
分别接种50～100 cfu 的金黄色葡萄球菌菌悬液于麦康凯液体培养基和麦康液体对照培养基中，在33.0 ℃的培养箱中培养不小于24 h，与对照培养基管比较，被检培养基管内试验菌应不得生长。
7.1.4 麦康凯琼脂培养基促生长能力及指示特性检查
用涂布法接种50～100 cfu 的大肠埃希菌菌悬液于麦康凯琼脂培养基和麦康凯琼脂对照培养基中，在33.0 ℃的培养箱中培养不大于18 h；试验菌株平行制备2 个平皿。与对照培养基比较，被检培养基上大肠埃希菌的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。
结论：大肠埃希菌检查用培养基适用性检查结果符合规定。
蛋白质水解指数(PI)：是指NPN占TN的百分比。TN含量测定：参照GB5009.5-2016凯氏定氮法。NPN含量测定：参考朱健辉[20]的方法，并略作修改。将样品自然解冻后，剔除可见脂肪和结蹄组织，切碎，称取5 g左右（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入40 mL蒸馏水，高速匀浆机匀浆3次，于4 ℃下放置1 h后，3000 r/min离心15 min，用快速滤纸过滤，取10 mL滤液加入等体积的10%三氯乙酸混合均匀，室温静置30 min，2500 r/min离心15 min，过滤，取10 mL滤液用凯氏定氮消化。
7.2 大肠埃希菌方法适用性试验
7.2.1 菌液制备
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌同7.1.1 项下供试液的制备。
6.3.3 供试品中微生物的回收
（1）供试液制备及阳性对照试液：取6.3 项下1：10 的供试液10 mL，加入胰酪大豆胨液体培养基至100 mL，重复三份，其中2 份为供试品组；另一份加入大肠埃希菌50～100 cfu/mL 作为试验组；另取大肠埃希菌50～100 cfu/mL加入胰酪大豆胨液体培养基至100 mL 作为阳性对照组；33.0 ℃培养18～24 h。
（2）阴性对照试验：取pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 mL，置于100 mL TSB 中，作为阴性对照，30～35 ℃培养18～24 h。取分别取上述培养物1 mL，接种至100 mL 麦康凯液体培养基中，43.0 ℃培养24～48 h。
（3）选择和分离培养：分别取供试液制备及阳性对照试液项下的培养物和阴性对照项下的培养物各1 mL，分别接种至100 mL 麦康凯液体培养基中，43.0 ℃培养24～48 h 后，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，33.0 ℃培养18～72 h，观察结果。
结论：大肠埃希菌适用性试验结果符合规定。
8 结论
根据上述适用性试验结果，确定本品的微生物限度检查法需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌采用平皿法进行检查，取供试品10 g，加pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL 中，振摇溶解，作为1：10 的供试液。需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌采用平皿法，依法检查（中国药典2015 年版），应符合规定。
(5)定期对槽上阳极板的导电头进行清理，将阳极板导电头擦拭干净，减少槽上导电头硫酸铜的含量；对槽上导电棒包铅损坏的阳极板挑出，进行修补或替换，始终保持槽面干净。
综上，把对底板的控制放在与顶帮控制同等重要的地位，在支护顶帮的同时进行底板的加固，使整个巷道形成由顶帮锚杆锚索锚固圈和底板注浆锚索锚固圈组成的整体承载结构，如图6所示。
8 供试品微生物限度检查结果
取3 批次采用平皿法检查，结果需氧菌培养和计数：2×10=20 cfu/g、1.5×10=15 cfu/g、1×10=10 cfu/g；霉菌和酵母菌培养和计数：0×10=0 cfu/g、0×10=0 cfu/g、0×10=0 cfu/g；控制菌检查：未检出、未检出、未检出。
结论：3 批次供试品微生物限度检查结果均符合规定。
9 试验结论
通过以上方法适用性试验，结果表明，西尼地平片（规格：5 mg）微生物限度检查采用《中国药典》2015 版平皿法，方法可行。
纳税人赡养一位及以上被赡养人的赡养支出,独生子女可按每月2000元的标准定额扣除;非独生子女可由其与兄弟姐妹分摊每月2000元的扣除额度,每人分摊的额度不能超过每月1000元。需要注意的是，被赡养人是指年满60岁的父母以及子女均已去世的年满60岁的祖父母、外祖父母。
参考文献
[1] 国家药典委员会.《中国药典》2015 年版二部[M].北京：中国医药科技出版社,2015.
[2] 国家药典委员会.《中国药典》2015 年版四部[M].北京：中国医药科技出版社,2015.
[3] 张伟.中国药典分析检测技术指南[M].北京：中国医药科技出版社,2015.
[4] 马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京：科学出版社,2000.
Applicability Test of Microbial Limit Test for Cilnidipine Tablets
CHEN Chao1, HAN Pei-lian2, YOU Rong-li3
(1.Beijing University of Chinese Medicine, Beijing, China;2.Shanxi Zhendong Taisheng Pharmaceutical Co., Ltd, Datong, Shandong, China;3.Shanxi Zhendong Pharmaceutical Co., Ltd, Changzhi, Shanxi, China)
ABSTRACT:Objective Study on the applicability of microbial limit test for Cinidipine Tablets. Methods The applicability of counting medium, the applicability test (recovery rate), the control bacteria test and the test article inspection were used. Results The applicability test of the microbial limit test method of cilnidipine tablets meets the requirements. Conclusion The applicability test showed that the microbial limit test of Cinidipine tablets (specification： 5mg) was feasible by using the four plates method of “Chinese Pharmacopoeia” 2015 edition.
KEY WORDS: Cilnidipine tablet; Microbial limit; Applicability of the method
中图分类号：R927.1
文献标识码：A
DOI：10.19613/j.cnki.1671-3141.2019.87.016
本文引用格式：陈超,韩佩莲,游蓉丽.西尼地平片微生物限度检查方法适用性试验[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(87)：33-34,40.
标签：培养基论文; 适用性论文; 微生物论文; 地平论文; 琼脂论文; 医药论文; 卫生论文; 药学论文; 药典论文; 药方集（处方集）论文; 药物鉴定论文; 《世界最新医学信息文摘》2019年第87期论文; 北京中医药大学论文; 山西振东泰盛制药有限公司论文; 山西振东制药股份有限公司论文;