菠萝AcFTL1和AcFTL2基因的克隆及功能鉴定

论文摘要

菠萝是世界上三大热带草本果树之一,由于其独特的风味儿和营养价值深受消费者青睐,因而具有较高的商业价值。近年来,我国菠萝产业在国内外市场中并不具备竞争优势。开花是植物从营养生长过度到生殖生长的转折阶段,对植物果实的形成、果实的产量和品质具有长远的影响。乙烯诱导菠萝开花是一种常规的栽培技术,但其分子机制的研究尚处于初始阶段。FT是植物中可将多种途径的开花诱导信号进行整合并传递给下游的花分生组织决定基因的重要调节因子,因而具有重要的研究价值。菠萝AcFT基因（NCBI注册号:HQ343233.1）的表达受乙烯调控,并且能够促进拟南芥开花时间提前大约6.8天并增加花絮的数量。本研究首先从“MD-2”菠萝中克隆了两个新的FT同源基因AcFTL1和AcFTL2,并利用实时荧光定量PCR技术检测了AcFTL1和AcFTL2基因与对照基因（AcFT）分别对低浓度（600ppm）和高浓度（1200 ppm）乙烯利的响应特性,然后通过生物信息学的方法分析了AcFTL1和AcFTL2蛋白的理化性质、保守结构域、亲缘关系和信号肽等。进一步构建了35S::AcFTL1、35S::AcFTL2过表达载体,并利用农杆菌介导法将其转化野生型拟南芥进行功能鉴定。最后利用酵母双杂交技术检测了AcFTL1、AcFTL2、AcFDL1、AcFDL2、Ac14-3-3L五个蛋白之间的相互作用关系。研究结果表明:（1）AcFTL1、AcFTL2和AcFT三个基因都能被低浓度和高浓度乙烯诱导表达,并且它们都是对高浓度乙烯更加敏感;然而AcFTL1和AcFTL2对低浓度和高浓度乙烯的敏感程度都远高于AcFT,尤其是AcFTL1;这说明AcFTL1和AcFTL2与AcFT相比更有可能是“MD-2”菠萝乙烯诱花过程中的关键基因;（2）AcFTL1和AcFTL2两个蛋白的近N端各含有一个信号肽,而且在系统进化树中,这两个蛋白与拟南芥FT/TFL亚家族中能够促进开花的成员（FT和TSF）的亲缘关系相对较近,说明它们在菠萝的细胞或组织中可能具有转运的功能,而且还可能与促进菠萝开花有关;（3）过表达AcFTL1基因可以使拟南芥花期提前1112天左右,而且还能使拟南芥莲座叶变皱（尤其是叶尖部位）;然而过表达AcFTL2基因则对拟南芥花期没有任何影响;（4）AcFTL1蛋白能分别与AcFDL1和AcFDL2蛋白相互作用,而不能与Ac14-3-3L蛋白直接相互作用,但Ac14-3-3L能够与AcFDL1和AcFDL2相互作用;而AcFTL2蛋白则不能够与AcFDL1、AcFDL2和Ac14-3-3L蛋白相互作用,说明AcFTL1、AcFDL1、AcFDL2和Ac14-3-3L蛋白可能能够形成AcFTL1-AcFDL1-Ac14-3-3L或AcFTL1-AcFDL2-Ac14-3-3L蛋白复合体,并调控下游基因的表达促进菠萝开花。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 植物开花的分子机制
•     1.2.1 植物开花诱导途径
•     1.2.2 开花信号整合因子
•     1.2.3 花分生组织决定基因
•     1.2.4 “ABCDE”模型
•   1.3 乙烯及其信号传导机制
•   1.4 菠萝开花分子机制的研究进展
•   1.5 研究目的及意义
• 第2章 AcFTL1和AcFTL2基因的表达量检测与克隆分析
•   2.1 引言
•   2.2 试验材料与试剂
•     2.2.1 试验材料
•     2.2.2 材料处理
•     2.2.3 酶
•     2.2.4 试剂盒
•     2.2.5 母液
•     2.2.6 培养基
•     2.2.7 实验仪器
•   2.3 试验方法与步骤
•     2.3.1 菠萝c DNA模板的制备
•     2.3.2 AcFTL1和AcFTL2及其相关基因的克隆
•     2.3.3 AcFTL1和AcFTL2基因的表达量检测
•     2.3.4 AcFTL1和AcFTL2蛋白的生物信息学分析
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 菠萝组织总RNA的完整性检测
•     2.4.2 AcFTL1和AcFTL2基因的克隆
•     2.4.3 AcFTL1和AcFTL2基因的相对表达量检测
•     2.4.4 AcFTL1和AcFTL2蛋白的生物信息学分析
•   2.5 结论与讨论
• 第3章 AcFTL1和AcFTL2基因功能鉴定
•   3.1 引言
•   3.2 材料与试剂
•     3.2.1 试验材料
•     3.2.2 酶
•     3.2.3 试剂盒
•     3.2.4 母液
•     3.2.5 培养基
•     3.2.6 菌种
•   3.3 试验方法与步骤
•     3.3.1 过表达载体构建
•     3.3.2 转基因拟南芥阳性株系的获取
•     3.3.3 转基因拟南芥的表型鉴定
•   3.4 结果与分析
•     3.4.1 过表达载体的构建
•     3.4.2 转基因拟南芥阳性植株的获取
•     3.4.3 转基因拟南芥的表型鉴定
•   3.5 结论与讨论
• 第4章 AcFTL1和AcFTL2与互作蛋白的酵母双杂交验证
•   4.1 引言
•   4.2 材料与试剂
•     4.2.1 试验材料
•     4.2.2 酶
•     4.2.3 试剂盒
•     4.2.4 母液
•     4.2.5 培养基
•   4.3 方法与步骤
•     4.3.1 AcFDL1、AcFDL2和Ac14-3-3L基因全长的克隆
•     4.3.2 诱饵和猎物载体的构建
•     4.3.3 Y2H-Gold酵母感受态的制备
•     4.3.4 自激活活性检测
•     4.3.5 诱饵蛋白与猎物蛋白的互作关系检测
•   4.4 结果与分析
•     4.4.1 AcFDL1、AcFDL2和Ac14-3-3L基因全长的克隆
•     4.4.2 诱饵载体与猎物载体的构建
•     4.4.3 诱饵蛋白的自激活活性检测
•     4.4.4 诱饵蛋白与猎物蛋白的互作关系检测
•   4.5 结论与讨论
• 第5章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 个人简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 耿宏叶

导师: 邹华文,徐立

关键词: 菠萝,乙烯,基因,蛋白,拟南芥,酵母

来源: 长江大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 长江大学

分类号: S668.3;Q943.2

总页数: 73

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