基于核磁共振的两种甲基化修饰蛋白检测

论文摘要

甲基化修饰是蛋白质翻译后修饰中的一种,在表观遗传调控中起着非常重要的作用,其机制研究受到广泛关注。核磁共振技术具有非侵入性,可提供近原位环境下蛋白质原子分辨率结构信息,在蛋白甲基化修饰研究中应用越来越广泛。然而,蛋白甲基化修饰的NMR检测往往需要同位素标记,很多蛋白的选择性标记困难,不具有普适性。这里我们采用最高量子相关谱（MAXY）在近原位环境下研究蛋白质的甲基化过程。由于MAXY谱中甲基基团最高量子态为四量子态,高于其他支链基团,可通过相干路径选择实现甲基信号的选择性检测。修饰甲基的化学位移特殊,远离其他支链甲基,使得原本二维谱检测简化成一维谱检测,大大提高了时间分辨率,有利于动态过程的实时检测;同时,支链甲基分布在分子表面,是很重要的相互作用和结构变化探针,因此该技术提供了一种简化的探针,可用于天然丰度蛋白质的构象和动力学研究。据此,我们分别以组蛋白和细胞色素c为对象展开了相关研究,主要研究内容及其结果如下:（1）组蛋白H3K4甲基化过程的实时检测:组蛋白是核小体的重要组成部分,甲基化是其最重要的翻译后修饰之一。组蛋白不仅甲基化位点多样,而且同一甲基化位点可以发生不同程度地甲基化。组蛋白不同程度、不同位点的甲基化具有不同的表观遗传调控功能。当前NMR技术可在近原位环境检测组蛋白Lys的甲基化过程,但通常需要选择性同位素标记Lys。对此,我们采用1H-13C MAXY技术,通过四量子滤波,实现了天然丰度蛋白质的组蛋白H3多肽甲基化程度及其甲基化过程的实时检测。对不同程度甲基化多肽的检测结果表明,甲基化修饰基团的化学位移通常远离常规支链甲基所处区域,处在支链CH区域,且不同程度甲基化基团的化学位移差异大。对稀溶液和细胞裂解液中组蛋白H3多肽的甲基化实时检测结果发现,该技术可消除复杂的背景信号干扰,在近生理条件（细胞裂解液）实现组蛋白的甲基化过程的实时动态观测。裂解液中H3的甲基化速率和程度均与稀溶液有很大差异,表明复杂环境影响组蛋白的甲基化。（2）基于MAXY表征细胞色素c的构象变化:细胞色素c是一个重要的多功能蛋白,它在呼吸链及细胞凋亡中均发挥着重要功能。细胞色素c的构象变化与其功能密切相关,表征细胞色素c的构象变化对于明确其发挥相关功能的分子机制至关重要。NMR是在近原位环境下表征蛋白构象的重要工具,但通常需要13C/15N等同位素标记。由于野生型细胞色素c存在翻译后修饰,故其同位素标记困难。在本文,我们尝试使用甲基化选择性检测1H-13C MAXY核磁共振技术来表征天然提纯的野生型细胞色素c的构象变化。通过1H-13C MAXY核磁共振技术得到的甲基谱图甲基信号分散性好,有效的滤掉了亚甲基、次甲基等其他信号,减少了谱峰的重叠程度,信号识别简单明了。通过突变体以及同位素标记,我们实现了对突变体细胞色素c的支链甲基归属。对突变体与野生型细胞色素c的甲基信号,我们发现两者信号几乎一致,从而指认得到了野生型细胞色素c的甲基信号。该结果表明野生型细胞色素c氧化态的构象与还原态的构象明显不同。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 引言
•   1.1 蛋白甲基化修饰
•   1.2 组蛋白甲基化
•     1.2.1 组蛋白赖氨酸甲基转移酶
•     1.2.2 组蛋白赖氨酸去甲基化酶
•     1.2.3 组蛋白甲基化的作用方式
•     1.2.4 组蛋白甲基化与疾病
•       1.2.4.1 组蛋白甲基化与恶性肿瘤
•       1.2.4.2 组蛋白甲基化的功能
•   1.3 甲基化Cytc的构象变化
•   1.4 甲基化蛋白质的研究现状
•   1.5 NMR研究甲基化修饰蛋白质
•     1.5.1 NMR的基本原理
•     1.5.2 化学位移的介绍
•     1.5.3 HMQC
•     1.5.4 研究甲基化蛋白的NMR方法
•   1.6 本文的研究方法与内容
• 第2章 基于MAXY研究组蛋白H3K4甲基化
•   2.1 前言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 实验材料及试剂
•     2.2.2 SET 7/9表达质粒的构建
•     2.2.3 SET 7/9表达与纯化
•     2.2.4 样品配制
•     2.2.5 NMR实验
•     2.2.6 实验数据处理
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 组蛋白H3（aa1-20）K4位单、双、三甲基化样品的甲基选择性检测
•     2.3.2 稀溶液与E.coli lysate中组蛋白H3（aa1-20）的K4位甲基化动态过程的检测
•   2.4 小结
• 第3章 基于MAXY表征细胞色素c
•   3.1 前言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 实验材料
•     3.2.2 y1 Cytc表达与纯化
•       3.2.2.1 y1 Cytc （K72A/C102T）表达质粒的构建
•       3.2.2.2 y1 Cytc （K72A/C102T）的表达与纯化
•       3.2.2.3 野生型y1 Cytc的表达与纯化
•     3.2.3 样品配制
•     3.2.4 NMR实验
•     3.2.5 实验数据处理
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 突变体y1 Cytc （K72A/C102T）侧链甲基归属
•     3.3.2 野生型的y1 Cytc的侧链归属
•   3.4 小结
• 第4章 总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 方仲佩

导师: 刘买利,张许

关键词: 组蛋白甲基化,核磁共振,细胞色素,构象表征

来源: 中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 物理学,生物学,生物学

单位: 中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)

分类号: Q75;O482.532

总页数: 55

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