猪星状病毒1型(PAstV1)GX1株的致病性研究

论文摘要

星状病毒（Astrovirus,AstV）是一种单股正链RNA病毒,无囊膜,直径约28-30nm。该病毒具有基因高度变异性和遗传多样性,且宿主范围广泛,具有跨种间传播并适应新宿主的能力,是一种潜在的人畜共患性病原。星状病毒被认为能引起人和其他多种动物腹泻,特别是人星状病毒（HAstV）被认为是仅次于轮状病毒的导致婴儿病毒性腹泻的第二大病原体。其他的致病性实验研究表明,星状病毒感染能引起火鸡、小鼠腹泻。猪星状病毒在全世界范围内广泛传播,具有较高的感染率,但其感染猪只导致的致病情况却不得而知。由于缺乏合适的星状病毒细胞培养系统和动物模型,导致人们对星状病毒的发病机制知之甚少。早期的火鸡雏鸡攻毒模型实验研究表明星状病毒只引起轻微的炎症反应,其腹泻是由于麦芽糖酶活性降低导致肠道对糖分的消化和吸收出现障碍而引起的渗透性腹泻。同时,有研究者用人星状病毒感染已分化的CaCo-2细胞发现,人星状病毒可引起F-肌动蛋白重排并增加肠屏障的通透性,使液体分泌到肠腔引起腹泻。实验室前期用猪星状病毒1型感染16日龄的哺乳仔猪的研究表明PAstV-GX1会引起仔猪轻度腹泻,但其致病机理仍然不清楚,因此本实验在此基础上进一步推进研究其致病机理。本研究将23头7日龄的哺乳仔猪,随机分为两个组,其中实验组12只,对照组11只。利用本实验室前期分离得到的猪星状病毒1型毒株（TCID50为1×10 4.5/ml）进行攻毒,攻毒后每天观察临床症状、采集粪便、量体温、称体重,并在攻毒后的第2,4,7天分别剖杀3只试验组和3只对照组仔猪,第10天剖杀3只试验组和2只对照组仔猪。用荧光定量PCR、免疫组化等方法研究猪星状病毒的致病性。结果表明:PAstV感染哺乳仔猪后产生一过性轻微症状,主要临床症状为轻微腹泻,食欲下降,生长缓慢;病理组织学变化显示感染仔猪的十二指肠、空肠和回肠肠粘膜上皮的绒毛发生变性、坏死和绒毛断裂或结构排列不整齐,大量淋巴细胞和嗜中性粒细胞浸润,肠系膜淋巴细胞不同程度的活化增生同时发生空泡变性,淋巴小结结构消失以及周边滤泡样活化增生,淋巴小结周边少量血管扩增充血等轻度炎症反应;荧光定量检测显示:1)排毒规律:与对照组相比,在实验组的粪便中检测到PAstV,且发现在攻毒后的第2-6天大量排毒,而第七天后仍然有排毒,但排毒量减少;2)组织病毒载量:实验组在攻毒后第二天、第四天和第七天肠道组织的病毒载量差异性极显著（P<0.01）,其中以回肠、十二指肠、空肠、肠系膜淋巴结中病毒含量较高。然而,攻毒后第十天的实验组和对照组只有回肠和结肠差异性显著（0.01<P<0.05）,实验组和对照组的其他组织的病毒载量差异性不显著（P>0.05）。总体来说,整个研究期间实验组中肠道组织的病毒载量先逐渐升高至第四天达到峰值便逐渐下降。IHC显示攻毒后第2,4,7和10天时实验组的肠绒毛细胞的细胞浆中检测到PAstV抗原,为淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒,呈弥漫性分布,但细胞核均未见染色。第2,4天检测到的抗原标记较多,而第7和第10天检测到的抗原标记较少,其中抗原标记的部位为十二指肠和空肠的绒毛以及回肠、盲肠、结肠、直肠的绒毛顶部。对照组的中未检测到免疫标记的PAstV抗原。通过以上研究初步证实了猪星状病毒对哺乳仔猪具有一定的致病性,且在攻毒后第10天仍有排毒现象,增加PAstV的传播风险。通过荧光定量PCR检测肠道组织细胞因子的变化情况发现:IFN-β和ISG54攻毒后呈上调趋势,IFN-β和ISG54在机体的抗病毒过程及机体天然免疫中起重要作用,表明猪星状病毒感染会刺激先天性免疫系统;通过荧光定量检测肠道组织的屏障通透性的变化情况发现:猪星状病毒感染后肠上皮细胞TJP1、TPJ2紧密连接蛋白和ZO-1（闭合小带蛋白1）的表达量减少,可能会导致肠屏障功能降低,通透性增加,因此推测PAstV攻毒后可能引起肠上皮细胞通透性增加,导致液体分泌到肠腔引起腹泻。本研究是首次对PAstV致病机理的研究,旨在为进一步了解猪星状病毒的致病性、致病机理,为后续深入研究猪星状病毒致病机制奠定基础,并为星状病毒的临床诊断、免疫和预防提供科学依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写对照表
• 第一章 综述
•   1.1 简介
•   1.2 AstV病原学特征
•     1.2.1 分类及形态结构
•     1.2.2 AstV的理化性质
•     1.2.3 基因组结构及特点
•     1.2.4 病毒的培养特性
•   1.3 星状病毒的遗传多样性和人畜共患潜力
•   1.4 星状病毒致病性研究进展
•   1.5 星状病毒的感染和免疫应答
•     1.5.1 星状病毒的感染
•     1.5.2 星状病毒的免疫应答
•   1.6 星状病毒与肠道上皮屏障的相互作用
•   1.7 星状病毒的流行病学
•     1.7.1 人星状病毒的流行病学
•     1.7.2 猪星状病毒的流行病学
•   1.8 星状病毒的诊断
•     1.8.1 临床和剖检变化
•     1.8.2 组织病理学变化
•     1.8.3 AstV的鉴定方法
•   1.9 星状病毒的防控与治疗
•   1.10 本研究的目的与意义
• 第二章 猪星状病毒1型（PAstV1） GX1株的致病性研究
•   2.1 材料与试剂
•     2.1.1 毒株与阳性质粒
•     2.1.2 实验动物
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 主要仪器设备
•     2.1.5 试剂配置
•     2.1.6 特异性引物
•   2.2 方法与步骤
•     2.2.1 阴性试验动物的筛选
•     2.2.2 实验动物分组
•     2.2.3 临床症状观察
•     2.2.4 病料采集
•     2.2.5 剖检变化
•     2.2.6 病毒载量的检测
•     2.2.7 排毒规律的检测
•     2.2.8 肠屏障通透性的检测
•     2.2.9 各肠段细胞因子的测定
•     2.2.10 组织病理学和形态学观察
•     2.2.11 肠道组织的免疫组化
•     2.2.12 统计分析
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 阴性猪筛选结果
•     2.3.2 体温变化情况
•     2.3.3 体重变化情况
•     2.3.4 临床症状观察结果
•     2.3.5 剖检病理变化
•     2.3.6 PAstV1 GX1荧光定量检测方法的构建
•     2.3.7 脏器病毒载量的检测
•     2.3.8 粪便排毒情况及排毒规律
•     2.3.9 肠屏障通透性的变化
•     2.3.10 细胞因子的变化
•     2.3.11 肠组织病理学和形态学的观察结果
•     2.3.12 肠道组织免疫组化
•   2.4 讨论
• 第三章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王翠

导师: 黄伟坚

关键词: 猪星状病毒,致病性,致病机理,肠屏障通透性

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 广西大学

分类号: S852.651

总页数: 82

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