导读:本文包含了活载体口服疫苗论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:尼罗罗非鱼,无乳链球菌,Sip蛋白,乳酸菌活载体疫苗
活载体口服疫苗论文文献综述
蔡玉臻,刘志刚,卢迈新,可小丽,高风英[1]（2019）在《尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果》一文中研究指出链球菌病是威胁我国罗非鱼养殖产业健康发展的重要病害之一。为研制出免疫效果好、操作简便的罗非鱼链球菌病疫苗,本研究构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的穿梭质粒pNZ8124-Sip,通过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得能够诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸菌活菌载体疫苗。采用SPS-PAGE电泳摸索最佳诱导浓度和诱导时间以获得最大表达量,通过镍柱纯化目的蛋白并进行Western blot检测;利用不同浓度的重组乳酸菌活载体疫苗灌胃口服免疫尼罗罗非鱼,采用间接ELISA法测定免疫后血清抗体水平变化,通过人工腹腔注射感染无乳链球菌获得相对免疫保护率。研究结果显示,构建的重组乳酸乳球菌可通过nisin诱导表达大小为48 ku特异性蛋白,与目的蛋白大小一致;PAGE电泳显示,重组蛋白主要以可溶蛋白和包涵体2种形式存在,其中胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL;诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h;Western blot检测结果显示,诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。口服免疫结果显示,中浓度组(2.24×10~(10) CFU/mL)和低浓度组(2.24×10~9 CFU/mL)免疫2次能够显着提高尼罗罗非鱼的血清抗体水平和抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为41.0%。本研究可为罗非鱼链球菌病口服疫苗的研究奠定基础,具有广阔的应用前景。(本文来源于《水产学报》期刊2019年03期）
蔡玉臻[2]（2018）在《尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果研究》一文中研究指出罗非鱼是我国重要的养殖品种之一,在我国南方广泛养殖。2009年以来我国南方主养区罗非鱼大范围暴发链球菌病,链球菌病的主要病原有海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(S.agalactiae)。目前针对罗非鱼无乳链球菌病尚无科学有效的防治措施,主要依赖抗生素类化学药物进行防治,易导致菌株耐药和药物残留。疫苗具有安全、高效、无残留等优点,可替代抗生素类药物成为罗非鱼链球菌病防控的重要途径。目前已有无乳链球菌灭活疫苗、减毒疫苗、DNA疫苗和基因工程亚单位疫苗等多种疫苗的报道,但其具有一定的局限性,使之不能进行大面积的推广。研制免疫方便、效果较好、易于工业化生产的新型疫苗已经成为防控罗非鱼链球菌病的主要趋势。本研究构建了重组表达无乳链球菌表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)的乳酸菌穿梭表达质粒,制备成乳酸菌活载体疫苗,通过灌胃口服的方式对其免疫原性进行了研究。研究内容和结果如下:1尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip基因穿梭表达质粒的构建及原核表达构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的分泌型穿梭表达质粒pNZ8124-Sip和非分泌型穿梭表达质粒pNZ8148-sip,通过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得能够诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸乳球菌。采用SDS-PAGE电泳摸索最佳诱导浓度和诱导时间以获得最大表达量,通过镍柱纯化目的蛋白并进行Western blot检测。研究结果显示:构建的分泌型重组乳酸乳球菌可通过nisin诱导表达大小为48KDa的特异性蛋白,非分泌型的表达蛋白为45KDa,与目的蛋白大小一致;SDS-PAGE电泳显示重组蛋白主要以胞内可溶性蛋白和包涵体2种形式存在,其中胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL;诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h;Western blot检测结果显示,诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。本研究成功构建了尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白非分泌型乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8148-sip和分泌型菌株NZ9000-pNZ8124-sip,并诱导表达出大量的胞内可溶性Sip蛋白,为尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗的制备提供了条件,为下一步的免疫原性检测奠定了基础。2尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗免疫原性研究为了探究尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗免疫原性,本研究将重组菌在最佳诱导条件下获得NZ9000-pNZ8124-sip、NZ9000-pNZ8148-sip重组菌分别以不同浓度(2.24×10~9 CFU/mL(低浓度组)、2.24×10~(10) CFU/mL(中浓度组)和2.24×10~111 CFU/mL(高浓度组))灌胃口服免疫尼罗罗非鱼,对照组分别灌胃口服等剂量的2.24×10~(10) CFU/mL的NZ9000-pNZ8124、NZ9000-pNZ8148和NZ9000菌株以及PBS溶液。隔周免疫1次,共免疫2次。第1次免疫后第1、2、4、8、16和21d采集各组罗非鱼血清样本,通过试剂盒方法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力、碱性磷酸酶(AKP)活力及溶菌酶(SOD)活性变化情况;采用间接ELISA法测定免疫后血清抗体水平变化;采集免疫后各组罗非鱼的胸腺、肝、脾和肠组织,通过荧光定量PCR方法检测其免疫相关基因IgT、IgM、CD8a、C3的相对表达量;首次免疫后第21d采用无乳链球菌腹腔注射人工感染各组罗非鱼,获得其相对免疫保护率(relative percent survival,RPS)。结果表明,分泌型和非分泌型重组乳酸菌活载体疫苗口服免疫后,中浓度组第一次免疫后IgT、IgM、CD8a、C3基因在胸腺、肝、脾脏、肠组织中的相对表达量均上调表达,随着时间的推移呈现下调趋势,第二次免疫后再次出现上调表达;攻毒前(第一次免疫后第21d)分泌型和非分泌型活载体疫苗中浓度组罗非鱼血清中的溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)活力和碱性磷酸酶(AKP)活力均显着高于PBS组。罗非鱼的血清抗体水平分泌型和非分泌型乳酸菌疫苗的NZ9000组、空载体组、NZ9000-8148-sip低浓度组和NZ9000-8124-sip高浓度组与PBS组无显着性差异;中浓度NZ9000-8124-sip(2.24×10~(10) CFU/mL)和低浓度NZ9000-8124-sip(2.24×10~9 CFU/mL)与PBS组有显着性差异,且随着时间推移呈现先增加后降低的趋势,分别在16d和4d达到峰值,中浓度组的抗体水平要高于低浓度组。无乳链球菌人工感感染实验结果表明,口服免疫2次能够显着提高罗非鱼抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为41.0%。罗非鱼的血清抗体水平非分泌型表达载体组的中浓度NZ9000-8148-sip(2.24×10~(10) CFU/mL)和高浓度NZ9000-8148-sip(2.24×10~(11) CFU/mL)与PBS组有显着性差异,且随着时间推移呈现先增加后降低的趋势,均在第21d达到峰值,中浓度组的抗体水平要高于低浓度组。免疫2次能够显着提高罗非鱼抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为61.6%。从整体的免疫效果分析非分泌型活载体疫苗的效果要优于分泌型。本研究可为罗非鱼链球菌病口服疫苗的研究奠定基础,具有广阔的应用前景。(本文来源于《上海海洋大学》期刊2018-05-22）
王红宁,杨鑫,周英顺,李玉玲,曹海鹏[3]（2014）在《禽传染性支气管炎活载体口服疫苗研究》一文中研究指出引言禽传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是广泛流行、严重危害养鸡业的重要传染病之一,由禽传染性支气管炎病毒(Avain Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起,疫苗免疫是控制该疾病的主要方法。由于IBV血清型多、同血清型之间缺乏有效的交叉保护、新的变异株不断出现等原因导致免疫失败,该病仍不断发生。活载体疫苗不仅可以针对毒株变异,搭载不同变异株的抗原基因,实现(本文来源于《中国畜牧兽医学会2014年学术年会论文集》期刊2014-11-08）
李世杰[4]（2013）在《微小隐孢子虫cp966基因重组乳酸杆菌口服活载体疫苗研究》一文中研究指出隐孢子虫病是世界范围内流行的水介寄生虫病，其病原体是顶复门、孢子虫纲、球虫亚纲、真球虫目、艾美耳亚目、隐孢子虫科、隐孢子虫属的原生动物。隐孢子虫病在家畜生产中导致了重大的经济损失。作为人兽共患的病原体，微小隐孢子虫可导致自限性腹泻在健康人群中爆发式流行；而对于免疫力低下人群，隐孢子虫感染将导致慢性的、甚至是致死性的腹泻。微小隐孢子虫卵囊可以在环境中长期存活并能抵抗常规水处理过程中的次氯酸消毒，这些特性成为控制饮用和娱乐用水中微小隐孢子虫污染的一大难题。迄今为止尚无针对微小隐孢子虫的特效药和高效预防微小隐孢子虫的疫苗，这进一步增加了防治隐孢子虫病的困难。基于可持续性发展、减少药物残留和降低药物依赖性考虑，发展微小隐孢子虫疫苗成为控制隐孢子虫病的一个绿色解决方案。植物乳酸菌作为食用益生菌，具有可口服、无毒、刺激粘膜免疫等特点，这些使其成为蛋白质及DNA口服疫苗的一个优秀的候选载体。本研究克隆微小隐孢子虫粘附相关基因文库的cp966基因，制备了cp966重组乳酸杆菌口服疫苗，观察了cp966重组乳酸杆菌口服疫苗对小鼠免疫的效果，评价了其对犊牛的免疫保护作用，取得了以下结果： cp966与GeneBank上预测的假定蛋白cgd4_4110基因序列的一致性达99.90%，蛋白质的序列一致性为100%，该蛋白定位在微小隐孢子虫子孢子膜上；利用cp966胞外区片段构建植物乳酸杆菌工程菌，口服免疫小鼠后，能诱发肠道粘膜免疫和体液免疫，肠道中的特异性sIgA和血液中的IgG含量均显着升高，Th2型免疫反应增强；口服免疫后可以增加小肠中TLR-4的表达，促进小鼠的先天性免疫。用cp966重组乳酸杆菌免疫犊牛后，诱导犊牛肠道粘膜免疫和体液免疫反应发生，犊牛小肠和粪便中的cp966特异性sIgA含量增多，血清中cp966特异性IgG含量上升，在人工感染微小隐孢子虫，血清中细胞因子IL-2、IL-12、IFNγ和IL-4含量上升；增加小肠粘膜中肥大细胞数量和犊牛抵抗微小隐孢子虫感染的能力；卵囊排出率平均减少67.14%，表明cp966重组植物乳酸杆菌对犊牛具有一定的免疫保护能力，免疫后可减轻微小隐孢子虫对犊牛的危害。综上所述，cp966可以作为微小隐孢子虫疫苗的候选基因。同阴性对照组和空白对照组相比，cp966重组乳酸杆菌疫苗对犊牛具有一定的保护效果，其免疫保护能力显着高于含有pW425et空载体的阴性对照组乳酸杆菌。(本文来源于《吉林大学》期刊2013-04-01）
陈建国[5]（2012）在《幽门螺杆菌CagA/UreB口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的研究》一文中研究指出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori, Hp)广泛存在于人类的胃中,是导致慢性胃炎、胃肠溃疡、胃腺癌等胃肠疾病的主要病原菌,已严重影响着人们的身体健康。尽管国内外采用抗生素叁联、四联疗法在治疗H. pylori引起相关的胃炎和胃溃疡等胃肠疾病方面取得了较大成果,但临床发现广谱抗生素的治疗导致幽门螺杆菌耐药菌株不断出现和治愈后复发率居高不下,临床上将很快进入“感染-治愈-复发-再治疗-耐药”的恶性循环,不能彻底解决问题。因此希望通过疫苗免疫奶牛使在牛奶中产生高水平的抗幽门螺杆菌抗体,通过口服该抗体,来预防和治疗H. pylori引起的慢性胃炎、胃肠溃疡等胃肠疾病。因此希望使用安全、高效、使用方便的疫苗来免疫动物产生高浓度抗体或用该疫苗免疫动物使之对幽门螺杆菌产生有效的抵抗力。本研究首先选取生产后10天健康、无乳腺疾病和生殖器官疾病、体温正常的奶牛14头,随机分为两组：PBS对照组和幽门螺杆菌全菌蛋白免疫注射组,每组7头。用浓度为2×1010cfu/mL的幽门螺杆菌(H. polyri)NCTC11637全菌经超声破碎后与等剂量的完全(不完全)弗氏佐剂充分乳化后分别于0、14、28天叁次多点肌肉注射全菌蛋白疫苗,每次4mL,免疫产后泌乳的健康奶牛,对照组每次注射PBS与弗氏佐剂乳化物4mL。每周采血和收集牛奶各一次,离心收集血清,以酶联免疫吸附试验测定血清、乳汁的IgG抗体,同时测量体温,观察发情和采食泌乳等健康情况。研究结果显示经肌注幽门螺杆菌全菌蛋白免疫奶牛后可在血清和乳汁中产生特异性抗体,抗体浓度显着高于对照组(P<0.05),但免疫结束后不久逐渐下降。免疫奶牛的体温、发情和采食泌乳等情况正常。但全菌蛋白疫苗费用高,制作麻烦,注射时阻力大、奶牛反应强烈,且需要多次多点注射。结果表明肌肉注射幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗是一个安全、有效的免疫途径。但全菌蛋白疫苗制作麻烦,费用高,注射时奶牛反应大。因此希望构建更加安全、高效和使用更为方便的疫苗代替幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗。考虑到幽门螺杆菌是肠道菌群,通过口服引起胃肠道粘膜免疫是一种可行途径。但口服的蛋白疫苗的制作复杂,提纯麻烦,且时间较长,同时需加相应的免疫佐剂提高免疫原性,在口服过程中蛋白疫苗还容易被胃酸及胃蛋白酶破坏而丧失免疫功能。因此考虑用大肠杆菌或减毒沙门氏菌来作为载体。本实验室多次采用减毒猪霍乱沙门氏菌C500作为载体,安全且免疫效果好,希望构建幽门螺杆菌的减毒猪霍乱沙门菌C500口服活载体疫苗。本实验选取幽门螺杆菌中已证实具有免疫原性的两个基因：尿素酶B(urease B, UreB)和细胞毒素相关抗原(cytotoxin-associated antigen, CagA)。先采用PCR技术从幽门螺杆菌标准株SS1扩增Hp-UreB和Hp-CagA基因,将其连接至原核表达质粒pYA3493中,使之构建为pYA3493-UreB-CagA重组质粒,经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列,并与GenBank中已发表的相关序列的进行同源性分析。重组质粒pYA3493-UreB-CagA电击转入减毒猪霍乱沙门菌C500,培养后筛选阳性菌落,抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。表达的UreB-CagA蛋白用SDS-PAGE和Western Blotting进行鉴定。然后将无特定病原菌昆明小鼠分成5组,每组10只,分别为肌肉注射幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗和灌胃分别给予含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500(0.2mL,1×1010CFUmL-1)、含空质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500(0.2mL,1×1010CFUmL-1)、减毒沙门氏菌C500(0.2mL,1×1010CFUmL-1)以及PBS (0.2mL)。每周免疫一次,连续五次。第六周后再用活H. pylori SS1(0.2mL,1×1010CFUmL-1)灌胃攻击,每天一次,连续叁天。第九周采血后处死实验小鼠,取一半胃粘膜和十二指肠研磨进行细菌培养检查H. pylori在胃肠定植情况,另一半用于组织切片和免疫组化观察胃肠损伤情况和免疫蛋白分泌的情况,同时对重要脏器肝、脾、肺进行组织切片观察损伤情况。实验前和实验后每隔一周或二周采血一次,连续8次,离心分离血清,采用ELISA检测小鼠血清中的抗体水平。检验pYA3493-UreB-CagA减毒猪霍乱沙门菌C500口服疫苗对小鼠的免疫效果和口服疫苗的安全性评价。结果：核苷酸序列测定及同源性分析证实,克隆的Hp-CagA和Hp-UreB基因与GenBank中相关序列的同源性分别为98%和100%(472／480和1134／1134)。重组质粒PYA3493-UreB-CagA转染减毒猪霍乱沙门菌C500,可表达约59kD的UreB-CagA蛋白。全菌蛋白注射组和含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500组的血清中幽门螺杆菌特异抗体滴度显着高于含质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500组、减毒沙门氏菌C500组以及PBS组(P<0.01)。但均未完全保护月=pylori SS1对胃的攻击,五组中胃和十二指肠均有H. pylori SS1的定植。但全菌蛋白注射组和含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500组小鼠胃肠内的菌落数量显着低于含质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500组、减毒沙门氏菌C500组以及PBS组(P<0.01)。免疫组化表明全菌注射组和口服疫苗中胃和十二指肠有明显的抗体存在,且所有组胃、十二指肠、肝、脾以及肺均无明显损伤,也无小鼠死亡。结果表明建立了同时表达Hp-CagA和Hp-UreB基因的减毒猪霍乱沙门菌疫苗株,该口服减毒沙门氏菌载体疫苗有明显的免疫预防效果,而且比较安全,但不能完全抑制幽门螺杆菌在胃和十二指肠中定植。以上是UreB-CagA双价口服活载体疫苗在小鼠体内的免疫效果,安全有效。体外实验希望通过构建H. pylori的CagA和UreB基因重组真核表达质粒用电击法转染到胃粘膜上皮细胞GES-1后,用幽门螺杆菌SSl攻击转染成功的胃上皮细胞((?)ES-1,观察对细胞凋亡及细胞形态的影响,探讨细胞凋亡机制。采用PCR技术从幽门螺杆菌标准株SS1中获取CagA部分基因和UreB全长基因与真核表达载体pEGFP-N1相连,构建幽门螺杆菌CagA/UreB真核荧光表达载体pEGFP-N1-CagA-UreB,并用脂质体的方法将质粒pEGFP-N1-UreB-CagA和空质粒pEGFP-N1分别转染到胃粘膜上皮细胞GES-1中,用(3418筛选阳性细胞,用幽门螺杆菌SSl分别处理转染pEGFP-N1-CagA-UreB的细胞、转染pEGFP-N1的细胞以及没转染质粒的细胞。用Annexin V-APC和7-AAD染色后,流式细胞术检测胃上皮细胞GES-1凋亡和死亡的情况,同时透射电镜观察胃上皮细胞GES-1的形态变化。结果发现用脂质体转染质粒到细胞GES-1,转染效率可高达60%以上,500μg G418可对转染细胞进行筛选,筛选后的阳性细胞用幽门螺杆菌处理后,凋亡率要小于空质粒转染的细胞和未转染质粒的细胞,但长时间处理后GES-1细胞均死亡,电镜结果显示细胞凋亡和坏死。结果表明质粒pEGFP-N1-UreB-CagA可转染到胃上皮细胞GES-1在培养细胞内的表达可抵抗幽门螺杆菌SSl对细胞GES-1的破坏,减少细胞凋亡。但用幽门螺杆菌长时间、大剂量处理也会导致细胞凋亡和坏死。这说明尿素酶B和CagA可导致细胞凋亡,但同时也有其他途径参与凋亡过程。(本文来源于《华中农业大学》期刊2012-11-01）
陈晓宇[6]（2008）在《表达TsoL18抗原的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗的构建》一文中研究指出囊尾蚴病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫囊尾蚴(Cysticercus cellulose)寄生于人或猪等而引起的人畜共患寄生虫病,是公认的世界经济病之一。囊尾蚴病在中国大部分地区尤其在少数民族地区是一个重要的公共卫生问题,严重威胁着人体健康,不仅如此,猪囊尾蚴病的广泛存在极大影响了我国畜产品在国际市场上的竞争力,给畜牧业造成重大经济损失,猪囊尾蚴病的免疫防治势在必行,然而在猪囊尾蚴病疫苗研究中,疫苗抗原的选择和来源一直困扰着兽医工作者。Tsol18是猪带绦虫六钩蚴(T. solium oncosphere)阶段特异性表达的抗原,主要在六钩蚴感染中间宿主的早期阶段分泌,其免疫血清在体外试验中能杀死六钩蚴,是猪囊尾蚴病疫苗研制的主要候选抗原之一。在已有的研究中,Tsol18重组蛋白在原核系统中多以包涵体形式表达,给蛋白质的复性和纯化带来许多困难,并且包涵体活性较低、保存期短、降解快,因而限制了Tsol18在猪囊尾蚴病疫苗研制上的应用。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种常见的侵袭性胞内菌,通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显着降低,但仍保留良好的侵袭力,可将免疫抗原直接递呈给免疫细胞而诱导特异性的免疫应答反应,减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗载体是目前疫苗免疫研究的热点之一。为了优化猪囊尾蚴病疫苗候选抗原Tsol18重组蛋白,探索猪囊尾蚴病口服重组活载体疫苗的免疫机制,研究其在猪囊尾蚴病免疫预防上的作用,进行了本项研究。收集成熟的猪带绦虫虫卵,经孵化和激活后,提取六钩蚴总RNA,设计特异性引物RT-PCR扩增Tsol18基因片段,并同义突变Tsol18基因片段中四个大肠杆菌低利用率密码子,截去其N端的16个氨基酸的信号肽编码序列,构建原核表达载体pGEX-4T-Tsol18并表达,进行GST-Tsol18重组蛋白的SDS-PAGE、Western-blot及稳定性分析,并以GST-Tsol18重组蛋白为抗原制备兔高免血清;将改造的Tsol18基因片段插入Asd+的组成型表达载体pYA3341,构建重组载体pYA3341-Tsol18,将重组载体电转化入缺失腺苷酸环化酶(Δcya)、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(Δasd)的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,研究重组活载体疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)表达Tsol18重组蛋白的免疫原性、生长稳定性、口服安全性及ELISA检测免疫小鼠血清中抗Tsol18抗体的产生情况,评价重组疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)的免疫效果。结果显示改造后的GST-Tsol18重组蛋白多以可溶性形式表达,蛋白表达量占菌体总蛋白的24%,Western-blot证明GST-Tsol18重组蛋白具有良好的抗原性,4℃保存120d只有20.1%降解,显示重组蛋白稳定性有很大改善。重组疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)在没有选择压力的情况下连续培养100代后,随机挑选的重组疫苗株全部都能生长和表达Tsol18重组蛋白,表明重组疫苗生长稳定;BALB/c鼠口服重组疫苗株2.0×1012cfu30天后,存活率100%,证实重组疫苗口服安全可靠。ELISA检测显示在二免后四周小鼠血清中抗Tsol18IgG抗体的OD值达到0.645,表明重组疫苗能激发机体产生免疫应答反应。本研究获得了具有高效表达、良好免疫原性和稳定性的猪囊尾蚴病疫苗候选抗原GST-Tsol18重组蛋白,构建了携带Tsol18重组蛋白的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗X4550(pYA3341-Tsol18),初步评价了重组疫苗的免疫效果,为猪囊尾蚴病基因工程疫苗的研制开拓了新的思路。(本文来源于《甘肃农业大学》期刊2008-06-01）
丁军涛[7]（2008）在《表达Tsol18抗原的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗的构建及其免疫学研究》一文中研究指出囊尾蚴病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)寄生于人或猪等而引起的人畜共患寄生虫病,是公认的世界经济病之一。囊尾蚴病在中国大部分地区尤其在少数民族地区是一个重要的公共卫生问题,严重威胁着人体健康,不仅如此,猪囊尾蚴病的广泛存在极大影响了我国畜产品在国际市场上的竞争力,给畜牧业造成重大经济损失,猪囊尾蚴病的免疫防治势在必行,然而在猪囊尾蚴病疫苗研究中,疫苗抗原的选择和来源一直困扰着兽医工作者。Tsol18是猪带绦虫六钩蚴(T.solium oncosphere)阶段特异性表达的抗原,主要在六钩蚴感染中间宿主的早期阶段分泌,其免疫血清在体外试验中能杀死六钩蚴,是猪囊尾蚴病疫苗研制的主要候选抗原之一。在已有的研究中,Tsol18重组蛋白在原核系统中多以包涵体形式表达,给蛋白质的复性和纯化带来许多困难,并且包涵体活性较低、保存期短、降解快,因而限制了Tsol18在猪囊尾蚴病疫苗研制上的应用。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种常见的侵袭性胞内菌,通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显着降低,但仍保留良好的侵袭力,可将免疫抗原直接递呈给免疫细胞而诱导特异性的免疫应答反应,减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗载体是目前疫苗免疫研究的热点之一。为了优化猪囊尾蚴病疫苗候选抗原Tsol18重组蛋白,探索猪囊尾蚴病口服重组活载体疫苗的免疫应答,研究其在猪囊尾蚴病免疫预防上的作用,进行了本项研究。收集成熟的猪带绦虫虫卵,经孵化和激活后,提取六钩蚴总RNA,设计特异性引物RT-PCR扩增Tsol18基因片段,并同义突变Tsol18基因片段中四个大肠杆菌低利用率密码子,截去其N端的16个氨基酸的信号肽编码序列,构建原核表达载体pGEX-4T-Tsol18并表达,进行GST-Tsol18重组蛋白的SDS-PAGE、Western blot及稳定性分析,并以GST-Tsol18重组蛋白为抗原制备兔高免血清;将改造的Tsol18基因片段插入Asd+的组成型表达载体pYA3341,构建重组载体pYA3341-Tsol18,将重组载体电转化入缺失腺苷酸环化酶(Δcya)、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(Δasd)的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,研究重组活载体疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)表达Tsol18重组蛋白的免疫原性、生长稳定性、口服安全性及在小鼠体内的分布情况,ELISA检测免疫小鼠血清和肠液中抗Tsol18抗体的产生情况,流式细胞术分析其脾细胞亚型的分化,ELISA检测免疫猪血清中抗Tsol18抗体的动态变化,探讨重组疫苗可能的免疫应答。结果显示改造后的GST-Tsol18重组蛋白多以可溶性形式表达,蛋白表达量占菌体总蛋白的24 %,Western blot证明GST-Tsol18重组蛋白具有良好的抗原性,4℃保存120 d只有20.1 %降解,显示重组蛋白稳定性有很大改善。重组疫苗4550(pYA3341-Tsol18)在没有选择压力的情况下连续培养100代后,随机挑选的重组疫苗株全部都能生长和表达Tsol18重组蛋白,表明重组疫苗生长稳定;BALB/c鼠口服重组疫苗株2.0×1012 cfu 30天后,存活率100 %,证实重组疫苗口服安全可靠,小鼠口服免疫后第21天在脾脏仍能测到大量的重组疫苗株,表明重组疫苗在体内能够长久存活,有利于刺激机体产生持久的免疫应答;ELISA检测显示在二免后四周小鼠血清中抗Tsol18 IgG抗体的OD值达到0.645,二免后六周小鼠肠液中有抗Tsol18分泌性IgA抗体产生,表明重组疫苗能诱导小鼠产生较强的抗体水平和激发多种免疫应答方式;免疫小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞数目明显增多,CD4+/CD8+ T细胞比值也显着增高(P<0.01),提示口服疫苗4550(pYA3341-Tsol18)可能同时诱导Th1和Th2免疫应答反应。猪免疫后20 d抗Tsol18 IgG抗体水平开始上升,在二免后30天抗体OD值达到1.025,表明重组疫苗能诱导猪产生抗猪囊尾蚴病的免疫应答效应。本研究获得了具有高效表达、良好免疫原性和稳定性的猪囊尾蚴病疫苗候选抗原GST-Tsol18重组蛋白,构建了携带Tsol18重组蛋白的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗4550(pYA3341-Tsol18),初步进行了重组疫苗的免疫学研究,为猪囊尾蚴病基因工程疫苗的研制和应用开拓了新的思路。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2008-05-25）
黄琴,李梅,胡春霞,李卫芬[8]（2008）在《乳酸乳球菌为活载体的鱼类口服外膜蛋白疫苗的研究》一文中研究指出嗜水气单胞菌是水产动物常见致病菌,其血清型众多,外膜蛋白是其共同的保护性抗原.根据已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因(omp)的核苷酸序列设计引物,扩增出嗜水气单胞菌 AS1.927 主要外膜蛋白的全长基因片段(Momp).将此基因片段插入表达载体 pNZ8048构建重组质粒,转化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000,制备表达嗜水气单胞菌主要外膜蛋白乳酸乳球菌活菌疫苗,并将该活菌疫苗口服免疫 BALB/c 小鼠。重组基因工程菌培养液上清的 SDS-PAGE 结果表明,经 Nisin 诱导后,主要外膜蛋白在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000获得有效表达. 免疫保护试验表明,免疫小鼠对同源菌株 AS1.927约100倍半数致死量的攻击的免疫保护率为 87.5%。经重组基因工程菌两次免疫后的小鼠血清中 IgG 水平显着高于对照组(P<0.01),说明分泌表达主要外膜蛋白的乳酸乳球菌能使小鼠产生有效的体液免疫反应.本试验结果提示,重组乳酸乳球菌能够有效地将外膜蛋白分泌到胞外并具有较好的免疫保护效果,这为解决抗嗜水气单胞菌引起的感染提供思路和嗜水气单胞菌外膜蛋白基因工程口服疫苗载体的产业化应用奠定基础.(本文来源于《第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集（上册）》期刊2008-04-01）
郭习勤[9]（2006）在《鼠疫亚单位疫苗和口服活载体疫苗的研究》一文中研究指出鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)引起的人畜共患烈性传染病,人间鼠疫包括肺鼠疫和腺鼠疫,腺鼠疫是通过跳蚤叮咬感染,Y.pestis迁移到肺部就会引起肺鼠疫感染,肺鼠疫能够通过气溶胶在人与人之间传播,在不予治疗的情况下死亡率高达100%。目前鼠疫仍是一个重要的公共卫生问题,世界上每年还有上千感染病例,主要分布在非洲、亚洲和南美洲。由于传统的鼠疫疫苗存在对肺鼠疫无效、副反应强烈等缺陷,至今世界还没有一种值得推广的鼠疫疫苗。一种理想的鼠疫疫苗应具备成本低、热稳定、能通过黏膜简便方法接种、能同时刺激机体产生体液和细胞免疫应答等特点,基于肺鼠疫的感染特点,激发黏膜免疫反应是预防肺鼠疫的研究重点。Y.pestis能产生很多由染色体或质粒编码的毒力因子,包括pgm、pst、Yops、F1抗原及V抗原等,由于这些毒力因子的致病作用机制尚不清楚,很难确定候选疫苗的组分。然而,诸多研究发现,F1和V抗原是鼠疫两大主要保护性抗原,也是鼠疫新型疫苗研究的重点。本研究就是以F1和V抗原为材料,进行鼠疫新型疫苗的探索,主要内容包括:1.从Y.pestis EV76株的质粒中钓取编码F1和V抗原的基因片段,并将二者融合克隆到原核表达载体pET11c上,转入宿主菌E. coli BL21,用IPTG诱导表达重组融合蛋白rF1-V,纯化后加入氢氧化铝佐剂制备鼠疫候选亚单位疫苗。2.将编码F1-V融合蛋白的基因,克隆到原核表达载体asd-pTrc99A,转入asd-大肠杆菌X6097,用电击转化经减毒沙门氏菌中间宿主asd- X3730转入减毒沙门氏菌终末宿主asd- X4072得到重组菌X4072(F1-V/99A),将菌体裂解液做Western-blot鉴定表达的F1-V融合蛋白。从而构建出稳定表达F1-V融合抗原的减毒沙门氏菌X4072(F1-V/99A),作为鼠疫口服疫苗候选株。3.以小鼠为动物模型进行鼠疫候选DNA疫苗(裸质粒F1-V/pVAX1)的安全性检测,通过接种动物的大体观察和称重等方法,进行急性毒性和长期毒性试验;提取组织DNA,通过PCR方法,检测质粒F1-V/pVAX1在小鼠组织的分布和滞留时间;用ELISA和ELISPOT方法进行抗核抗体检测。初步验证裸质粒F1-V/pVAX1的安全性,为下一步口服活载体DNA疫苗的研究提供依据。4.将编码F1-V融合抗原的基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,转入asd-大肠杆菌X6212,再依次将重组质粒转化asd-减毒沙门氏菌X3730、X4550,得到重组减毒沙门氏菌X4550(F1-V/AP),提取重组质粒转染COS-7细胞,用免疫组化和Western-blot(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2006-06-01）
活载体口服疫苗论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
罗非鱼是我国重要的养殖品种之一,在我国南方广泛养殖。2009年以来我国南方主养区罗非鱼大范围暴发链球菌病,链球菌病的主要病原有海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(S.agalactiae)。目前针对罗非鱼无乳链球菌病尚无科学有效的防治措施,主要依赖抗生素类化学药物进行防治,易导致菌株耐药和药物残留。疫苗具有安全、高效、无残留等优点,可替代抗生素类药物成为罗非鱼链球菌病防控的重要途径。目前已有无乳链球菌灭活疫苗、减毒疫苗、DNA疫苗和基因工程亚单位疫苗等多种疫苗的报道,但其具有一定的局限性,使之不能进行大面积的推广。研制免疫方便、效果较好、易于工业化生产的新型疫苗已经成为防控罗非鱼链球菌病的主要趋势。本研究构建了重组表达无乳链球菌表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)的乳酸菌穿梭表达质粒,制备成乳酸菌活载体疫苗,通过灌胃口服的方式对其免疫原性进行了研究。研究内容和结果如下:1尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip基因穿梭表达质粒的构建及原核表达构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的分泌型穿梭表达质粒pNZ8124-Sip和非分泌型穿梭表达质粒pNZ8148-sip,通过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得能够诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸乳球菌。采用SDS-PAGE电泳摸索最佳诱导浓度和诱导时间以获得最大表达量,通过镍柱纯化目的蛋白并进行Western blot检测。研究结果显示:构建的分泌型重组乳酸乳球菌可通过nisin诱导表达大小为48KDa的特异性蛋白,非分泌型的表达蛋白为45KDa,与目的蛋白大小一致;SDS-PAGE电泳显示重组蛋白主要以胞内可溶性蛋白和包涵体2种形式存在,其中胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL;诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h;Western blot检测结果显示,诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。本研究成功构建了尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白非分泌型乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8148-sip和分泌型菌株NZ9000-pNZ8124-sip,并诱导表达出大量的胞内可溶性Sip蛋白,为尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗的制备提供了条件,为下一步的免疫原性检测奠定了基础。2尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗免疫原性研究为了探究尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗免疫原性,本研究将重组菌在最佳诱导条件下获得NZ9000-pNZ8124-sip、NZ9000-pNZ8148-sip重组菌分别以不同浓度(2.24×10~9 CFU/mL(低浓度组)、2.24×10~(10) CFU/mL(中浓度组)和2.24×10~111 CFU/mL(高浓度组))灌胃口服免疫尼罗罗非鱼,对照组分别灌胃口服等剂量的2.24×10~(10) CFU/mL的NZ9000-pNZ8124、NZ9000-pNZ8148和NZ9000菌株以及PBS溶液。隔周免疫1次,共免疫2次。第1次免疫后第1、2、4、8、16和21d采集各组罗非鱼血清样本,通过试剂盒方法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力、碱性磷酸酶(AKP)活力及溶菌酶(SOD)活性变化情况;采用间接ELISA法测定免疫后血清抗体水平变化;采集免疫后各组罗非鱼的胸腺、肝、脾和肠组织,通过荧光定量PCR方法检测其免疫相关基因IgT、IgM、CD8a、C3的相对表达量;首次免疫后第21d采用无乳链球菌腹腔注射人工感染各组罗非鱼,获得其相对免疫保护率(relative percent survival,RPS)。结果表明,分泌型和非分泌型重组乳酸菌活载体疫苗口服免疫后,中浓度组第一次免疫后IgT、IgM、CD8a、C3基因在胸腺、肝、脾脏、肠组织中的相对表达量均上调表达,随着时间的推移呈现下调趋势,第二次免疫后再次出现上调表达;攻毒前(第一次免疫后第21d)分泌型和非分泌型活载体疫苗中浓度组罗非鱼血清中的溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)活力和碱性磷酸酶(AKP)活力均显着高于PBS组。罗非鱼的血清抗体水平分泌型和非分泌型乳酸菌疫苗的NZ9000组、空载体组、NZ9000-8148-sip低浓度组和NZ9000-8124-sip高浓度组与PBS组无显着性差异;中浓度NZ9000-8124-sip(2.24×10~(10) CFU/mL)和低浓度NZ9000-8124-sip(2.24×10~9 CFU/mL)与PBS组有显着性差异,且随着时间推移呈现先增加后降低的趋势,分别在16d和4d达到峰值,中浓度组的抗体水平要高于低浓度组。无乳链球菌人工感感染实验结果表明,口服免疫2次能够显着提高罗非鱼抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为41.0%。罗非鱼的血清抗体水平非分泌型表达载体组的中浓度NZ9000-8148-sip(2.24×10~(10) CFU/mL)和高浓度NZ9000-8148-sip(2.24×10~(11) CFU/mL)与PBS组有显着性差异,且随着时间推移呈现先增加后降低的趋势,均在第21d达到峰值,中浓度组的抗体水平要高于低浓度组。免疫2次能够显着提高罗非鱼抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为61.6%。从整体的免疫效果分析非分泌型活载体疫苗的效果要优于分泌型。本研究可为罗非鱼链球菌病口服疫苗的研究奠定基础,具有广阔的应用前景。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
活载体口服疫苗论文参考文献
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