导读:本文包含了敬钊缨毛蛛毒素论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:毒素,通道,膜片,门控,电压,离子,蜘蛛。
敬钊缨毛蛛毒素论文文献综述
鲍邵衡[1]（2014）在《敬钊缨毛蛛毒素的异源表达及其电生理活性研究》一文中研究指出敬钊蜘蛛(Chilobrachys jingzhao)是生长于我国南方的一种具有毒性的狼蛛,其毒液中成分十分复杂。目前已从敬钊狼蛛中分离纯化出了超过60种毒素多肽。而敬钊毒素3(Jingzhaotoxin-III,JZTX-III)就是从此种狼蛛中分离纯化得到的一种多肽类神经毒素。JZTX-III由36个氨基酸残基组成,并且含有3对二硫键。它能够选择性地作用于分布在心肌细胞膜上的人的钾离子通道h Kv2.1和人的钠离子通道h Nav1.5,具有较高的研究价值。由于从天然蜘蛛毒液中分离得到JZTX-III的量很少,并且尚未通过原核表达的方法获得此种毒素,我们将利用半乳糖自动诱导系统帮助E.coli SHuffle T7 Express菌种原核表达JZTX-III以提高其产量。通过优化,我们得到最佳自动诱导条件为30℃、220 rpm震荡培养16 h,并且在此条件下经过镍柱和RP-HPLC纯化得到的r JZTX-III的产量高达12.1 mg/L。质谱结果显示r JZTX-III具有正确的分子量,说明表达成功。后期电生理实验结果也表明r JZTX-III具有对h Nav1.5的抑制活性。为证明此表达系统具有一定的适用性,我们还利用半乳糖自动诱导系统表达r JZTX-46。JZTX-46是从敬钊狼蛛毒腺所构建的DNA文库中发现的一类功能未知的毒素,它由30个氨基酸残基构成并且含有3对二硫键。经过质谱检测,表达纯化得到的r JZTX-46的分子量与理论值吻合,说明r JZTX-46表达成功,也同时说明了半乳糖自动诱导SHuffle菌种表达富含二硫键多肽的策略具有一定的适用性。由于JZTX-46与已知的JZTX-XII的同源性很高,我们参考JZTX-XII的特异性检测了JZTX-46对h Nav1.5和h Nav1.7通道的活性,并发现无显着作用。我们还将检测其对钾离子通道及其它通道的作用。本文中我们还详细描述了用于切割r JZTX-III和r JZTX-46融合蛋白中SUMO标签的Ulp激酶的制作工艺。由于以往购买Ulp激酶的费用很高,我们利用原核表达的方法得到了较纯的Ulp激酶。经过酶切实验验证,表达Ulp激酶具有较高的活性,每1μl Ulp激酶在30℃下1 h能够切割33μg的底物。(本文来源于《国防科学技术大学》期刊2014-11-01）
罗吉[2]（2014）在《敬钊缨毛蛛毒素与电压门控钠离子通道作用机制研究》一文中研究指出蜘蛛所产生的具有生物活性的多肽毒素,可以选择性地作用于不同的靶标分子,例如电压门控钠离子通道。正是因为蜘蛛多肽毒素具有作用高效性和专一性的特点,故可以用来进行药理学实验研究和药物研究开发实验,同时也可以用作研究其靶标分子结构和功能的工具试剂分子。敬钊缨毛蛛是一类地下穴居的原始蜘蛛,隶属狒蛛科、棒刺蛛亚科、缨毛蛛属,是近年在我国发现的一蜘蛛新种。从其粗毒中分离纯化得到的29个氨基酸残基构成的多肽毒素--敬钊缨毛蛛毒素V,能够有效抑制大鼠背根神经节(ratDRG)上的河豚毒素敏感型和不敏感型电流,其半有效抑制浓度分别为30.2nM和27.6nM。首先,在本课题中,我们深入地研究了敬钊缨毛蛛毒素V的结构和功能,证明了其是一种作用于电压门控钠离子通道亚型Nav1.4的强抑制剂,其对Nav1.4的半有效抑制浓度为5.12nM,强于其对大鼠背根神经节(ratDRG)上的河豚毒素敏感型和不敏感型电流的抑制作用。在对其电压门控钠离子通道亚型选择性的筛选研究过程中,我们选用了四种电压门控钠离子通道亚型,分别为Nav1.3,Nav1.4,Nav1.5和Nav1.7。实验结果表明JZTX-V对Nav1.4的抑制作用最强,而对Nav1.5的抑制作用最弱,其半有效抑制浓度分别为：hNav1.3,292±61nM；rNav1.4,5.12±0.87nM,hNav1.5,2.7±0.779μM和hNav1.7,61.7±1.2nM,同时拟合得出的时间常数值为34.01±6.81s(rNav1.4),133.33±27.96s(hNav1.7),48.54±11.35s(hNav1.3)和34.24±8.13s(hNav1.5),此实验结果可以证明敬钊缨毛蛛毒素V能够高效且快速地作用于电压门控钠离子通道亚型Nav1.4。敬钊缨毛蛛毒素V(JZTX-V)可以有效地抑制Nav1.4的峰电流值,但是在其亚饱和浓度时,敬钊缨毛蛛毒素V对于Nav1.4的稳态激活和稳态失活都无明显作用,但是却可以改变稳态激活和稳态失活曲线的中点斜率。接下来,我们通过化学合成的敬钊缨毛蛛毒素V的单点突变体来研究其和Nav1.4相互作用的生物学活性位点。研究结果表明,一方面,和野生型的敬钊缨毛蛛毒素V相比,叁个疏水性残基(W5,M6和W7)的甘氨酸单点突变体可以显着地降低敬钊缨毛蛛毒素V对Nav1.4的峰电流抑制作用。通过希尔方程拟合后,可以得出不同的敬钊缨毛蛛毒素V单点突变体对钠离子通道亚型Nav1.4的半有效抑制浓度为0.313±0.26(W5A),0.252±0.45(M6A)和1.92±0.31(W7A)μM。和野生型的敬钊缨毛蛛毒素V相比,其半有效抑制浓度分别提高了61(W5A),49(M6A)和375(W7A)倍。另一方面,和野生型的敬钊缨毛蛛毒素V相比,两个带正电荷的残基(R20和K22)的甘氨酸突变体可以显着降低敬钊缨毛蛛毒素V和Nav1.4的作用。通过希尔方程拟合后,可以得出不同的敬钊缨毛蛛毒素V单点突变体对钠离子通道亚型Nav1.4的半有效抑制浓度为2.1±0.28(R20A)和0.659±0.011(K22A)μM。和野生型的敬钊缨毛蛛毒素V相比,其半有效抑制浓度分别提高了410(R20A)和128倍(K22A)。由此可知,敬钊缨毛蛛毒素V具有两个生物学活性表面,其中一个为疏水性生物学活性表面,由叁个疏水性氨基酸残基组成(W5,M6和W7)；而另一个生物学活性表面由带正电荷氨基酸的残基所组成(R20和K22)。根据其同源模建的结构来看,敬钊缨毛蛛毒素V的带正电荷生物学活性表面位于其疏水性生物学活性表面的周围。先前的关于敬钊缨毛蛛毒素V的磷脂实验表明,敬钊缨毛蛛毒素V表面的带正电荷的氨基酸残基有可能参与到毒素和离子通道的结合过程当中,这一点在本实验中得到验证。关于敬钊缨毛蛛毒素V和电压门控钠离子通道的关键位点研究结果表明,在我们突变的61个氨基酸残基中,其包括所有位于电压门控钠离子通道亚型Navl.4的不同的结构域的不同的胞外连接环,并没有鉴定到对JZTX-V的抑制作用改变特别明显的单点突变体,由此可以知道JZTX-V不作用于电压门控钠离子通道Nav1.4的胞外连接环上。其次,本论文还研究了β1亚基是否在敬钊缨毛蛛毒素V和Nav1.4的相互作用中起到一定的作用。研究结果表明,首先,β1亚基可以明显调节表达于HEK293细胞上的Nav1.4的动力学特征。再次,我们研究发现β1亚基可以降低敬钊缨毛蛛毒素V和电压门控钠离子通道亚型Nav1.4的亲和性,也就是说,β1亚基可以阻碍敬钊缨毛蛛毒素V和Nav1.4的作用。再次,本论文还研究了导致低血钾周期性麻痹疾病的单点突变Nav1.4R222W的离子通道动力学特征,研究结果表明,和野生型的钠离子通道Navl.4相比,导致低血钾周期性麻痹疾病的单点突变Nav1.4R222W可以使激活曲线向去极化方向漂移近6mV；这一单点突变体还可以使失活曲线向超极化方向漂移近5mV。这些在离子通道动力学方面的改变,可也加强钠离子通道Nav1.4的失活作用,导致在静息电位下可激活的钠离子通道数目的减少,以至于无法爆发足够的动作电位,最终导致肌肉的麻痹。据临床报道,临床常用药物乙酰脞胺对此类患者毫无疗效,乙酰脞胺的药理作用为改变细胞外的pH值。但是根据我们的研究,这种导致低血钾周期性麻痹疾病的单点突变Nav1.4R222W和之前发现的此类疾病的单点突变体所不同的是,这类突变体对胞外pH值得变化不敏感,其胞外pH值的变化对其无任何调节作用,由此导致药物乙酰脞胺的对此类患者无任何治疗效果。我们的研究结果解释了为什么突变体Nav1.4R222W会导致低血钾周期性麻痹以及为什么药物乙酰脞胺的对此类患者无疗效。综上所述,我们的研究实验数据表明,和Nav1.4相关单点突变体可以导致严重肌肉疾病的发生,以及敬钊缨毛蛛毒素V是一种可以高效且快速作用于Nav1.4的多肽分子抑制剂,一方面,为研究电压门控钠离子通道的结构和功能提供了一个新的分子试剂,另一方面也为肌肉疾病类药物的开发提供了一个先导分子。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2014-10-01）
张立钊[3]（2014）在《敬钊缨毛蛛毒素-V对治疗CCI大鼠神经病理性疼痛的研究》一文中研究指出目的：研究鞘内注射敬钊缨毛蛛毒素-V对大鼠坐骨神经慢性压迫损伤性神经病理性疼痛的作用,为敬钊缨毛蛛毒素-V治疗神经病理性疼痛提供实验依据。方法：选择成年健康雄性SD大鼠60只,体重250-300g,随机分成6组(n=10)：对照组：单纯CCI处理组(N组)；CCI+硬膜外置管+鞘内注射盐水组：(ctrl组)；CCI+硬膜外置管+鞘内注射吗啡组：(M组)；敬钊缨毛蛛毒素-V (JZTX-V)实验组：CCI+硬膜外置管+鞘内注射JZTX-V组,该组分为叁组：鞘内注射20μg/kg JZTX-V (J1组)；鞘内注射40μg/kg JZTX-V(J2组)；鞘内注射60μg/kg JZTX-V(J3组)。手术处理前一天测基础机械痛阂值。除N组只做CCI外,其余各组行处理均行CCI+硬膜外置管处理,将各组不合要求的大鼠予以剔除,术后3天、5天、7天测定机械痛阈值并观察大鼠的行为学表现,术后第7天除N组外,其余各组术后经鞘内置管分别注入生理盐水、吗啡或不同剂量JZTX-V,注射完毕后0.5h、1h、1.5h、2h分别完成机械痛阈的测定。给药后比较各组大鼠的痛阈值的差异,并比较各组大鼠的不良反应。结果：1.N组中因术中麻醉过量致死1只,术后发现大鼠术侧后肢瘫痪1只；CCI+鞘内置管各组中,术中出现死亡2只,术后第1-2天出现死亡4只,术后第二天瘫痪4只,其余大鼠行为表现较术前无特殊改变。各组大鼠术后的机械痛阈值较基础痛阈值明显下降(P<0.05),其中同一时点N组与CCI+鞘内置管各组术后机械痛阈值下降水平无差异(P>0.05)。2.给药后同一时点,M、J1、J2、J3组与ctrl组相比,大鼠机械痛阈值均升高(P<0.05)。M组给药后1h大鼠机械痛阈值达到高峰,给药后2h大鼠机械痛阈值恢复到给药前水平,J、J2组给药后1h大鼠的机械痛阈达到高峰,给药后2h大鼠的机械痛阈依然高于给药前水平。J3组在给药后1.5h大鼠的机械痛阈达到高峰,给药后2h机械痛阈值高于给药前水平,并且高于J组,与J2组持平。3.给药后同一时点,J1、J2、J3组相比,大鼠机械痛阈值J3>J2>J1(P<0.05)。4.J3组药物在最佳镇痛活性的时间点,大鼠机械痛阈值水平不及M组(P<0.05),但大鼠的机械痛阈下降较M组缓慢。5.鞘注JZTX-V对大鼠的运动机能未见明显影响,大鼠正常采食,肢体运动等日常活动情况较给药前未见明显变化,未出现死亡情况,证明鞘注JZTX-V有一定的实验安全性。结论：1.鞘注JZTX-V可以缓解CCI大鼠机械痛敏反应,产生明显的镇痛效应,镇痛效应呈现明显的剂量效应。2.鞘注JZTX-V对CCI大鼠机械痛的镇痛作用效果与吗啡相比,在表现出最佳镇痛活性的时间点JZTX-V的作用强度不如吗啡,但其镇痛作用持续时间较吗啡长。3.鞘注JZTX-V对大鼠运动无明显影响,实验安全性较高。4. JZTX-V可作为治疗神经病理性疼痛的一种有效方法,同时可为进一步研发神经病理性疼痛药物提供新的思路与方法。(本文来源于《中南大学》期刊2014-05-01）
芦敏[4]（2012）在《敬钊缨毛蛛毒素-Ⅰ和Ⅲ抑制Na_v1.5快速失活的分子机制研究》一文中研究指出前期研究报道,敬钊缨毛蛛毒素-Ⅲ (jingzhaotoxin-Ⅲ, JZTX-Ⅲ)选择性抑制心肌细胞钠离子通道Nay1.5,结合位点位于钠通道第四结构域(Domain Ⅱ, DIDS3-S4 loop上,是一种位点4毒素。但是,JZTX-Ⅲ关键残基突变降低毒素亲和力约100倍,而hNav1.5 D Ⅱ关键残基R800突变降低仅18倍左右,说明JZTX-Ⅲ很可能还存在其它结合位点。在本课题研究中,我们发现高浓度JZTX-Ⅲ(如1μM和5μM)除抑制Nav1.5通道电流大小外,还能同时延缓Nav1.5的快速失活。高浓度的JZTX-Ⅲ同样对Nav1.5通道Domain Ⅱ突变体R800A的电流也有延缓失活作用。而通道的失活通常与通道的第四结构域(Domain Ⅳ, DⅣ)相关,因此我们将Nav1.5DⅣS3-S4胞外连接环进行丙氨酸扫描突变。实验结果发现,该区域确实存在JZTX-Ⅲ的结合靶点---Q1612和K1613。该通道突变体Q1612A和K1613A增加JZTX-Ⅲ对Nav1.5的IC50值分别达7.9和8.2倍。由于JZTX-Ⅲ选择性作用于钠通道亚型Navl.5,而对Nav1.7无明显作用,我们将Q1612和K1613在Nav1.7上的对应位点E1589和T1590突变,JZTX-Ⅲ对Nav1.7通道结合力大大增强。本研究结果表明,JZTX-Ⅲ不同于以往报道的位点4毒素,其在心肌通道Nav1.5上有2个结合位点。JZTX-Ⅲ有可能作为工具试剂研究心肌钠通道Nav1.5的DⅡ S4和DⅣS4电压敏感元件结构和功能的异同。敬钊缨毛蛛毒素-Ⅰ(jingzhaotoxin-Ⅰ, JZTX-Ⅰ),是一种类α-毒素的多肽毒素,偏爱作用于心肌细胞钠离子通道Nav1.5。JZTX-Ⅰ能抑制表达在HEK293T细胞上的人源心肌细胞钠通道亚型Nav1.5的快速失活,其抑制半数有效浓度(IC50)为339.8+0.04 nM。我们采用定点突变的方法对心肌钠离子通道Nav1.5第四结构域DIV S3-S4胞外连接环上的氨基酸残基进行了丙氨酸扫描突变,实验发现JZTX-Ⅰ作用于Nav1.5 DⅣ的关键残基为D1609和K1613。它们突变后能降低JZTX-Ⅰ对Nav1.5的结合能力分别达29.5和4.2倍。本实验结果证实了JZTX-Ⅰ为位点3毒素,并成功找到了JZTX-Ⅰ在Nav1.5通道上的作用靶点,即一个酸性氨基酸D1609和一个碱性氨基酸K1613。JZTX-Ⅰ有可能作为工具试剂研究心肌钠通道Nav1.5的电压敏感元件。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2012-06-01）
粟海波[5]（2012）在《敬钊缨毛蛛毒素34抑制钠通道亚型Nav1.7的分子机制研究》一文中研究指出蜘蛛多肽毒素因其分子多样性、高亲和力、高特异性等特点而被认为是研究电压门控钠离子通道结构与功能的重要分子探针。敬钊缨毛蛛毒素34 (JZTX-34)是一种从敬钊缨毛蛛粗毒中分离出来的抑制剂半胱氨酸结多肽毒素。前期研究发现,JZTX-34能够选择性抑制大鼠背根神经节(DRG)细胞膜上表达的河豚毒素敏感(TTX-S)钠离子通道电流,而对河豚毒素敏感型不敏感(TTX-R)钠离子通道电流无明显作用。然而,JZTX-34与钠通道相互作用的分子机制尚知之甚少。本项研究通过芴甲氧羰基(Fomc)固相多肽合成方法成功合成了JZTX-34,经反复向高效液相色谱分离纯化、谷胱甘肽氧化复性后,基质辅助激光解离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF/MS)和膜片钳电生理检测发现化学合成JZTX-34与天然毒素的相对分子质量和生理活性具有一致性。进一步研究发现,JZTX-34能选够择性抑制Nav1.7(IC50～610nM)和Nav1.3 (IC50～7.95μM),而对Nav1.5和Nav1.8没有作用。JZTX-34不改变Nav1.7的电流-电压(Ⅰ-Ⅴ)曲线和稳态激活,却能使Nav1.7稳态失活向超极化方向漂移约9mV。JZTX-34能够明显抑制嵌合体Nav1.7(Nav1.5-DⅣ-S3-S4)和嵌合体Nav1.5(Nav1.7-DⅡ-S3-S4)电流,IC50分别为706.3nM和1.05μM。Nav1.7突变体D816R使毒素和通道的亲和力降低了约32倍；同时,Nav1.5反向突变体R800D显着增强了毒素对通道的亲和力。实验结果表明JZTX-34可能是一种位点4毒素。与其他的位点4毒素相比,狼蛛毒素ProTx-Ⅱ作用于钠通道DⅡ和DⅣ区域并影响钠通道快速失活,而p-蝎毒作用于钠通道DⅡ区域并影响钠通道的激活；JZTX-34通过作用于D Ⅱ而不是DⅣ影响钠通道的稳态失活,这表明JZTX-34可能采用一种不同的分子机制与钠通道相互作用。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2012-06-01）
邓梅春[6]（2010）在《敬钊缨毛蛛毒素与虎纹捕鸟蛛毒素的结构与功能研究》一文中研究指出敬钊缨毛蛛(Chilobrachys jingzhao)是在我国海南省发现的具有很强毒性的大型蜘蛛。我们从敬钊缨毛蛛毒液中鉴定出了多种具有影响离子通道活性的多肽成分,并且选择了其中四种多肽成分进行深入研究。为了确定JZTX-V作用于钠通道的关键残基,通过固相化学合成的方法,我们将JZTX-V进行了丙氨酸扫描,获得了19个突变体。结果发现：其中15个突变体对大鼠背根神经节(DRG)细胞TTX-不敏感型(TTX-R)钠通道的活性降低了13-531倍,这些残基应该是JZTX-V结合TTX-R钠通道的关键残基；5个突变体对大鼠DRG细胞TTX-敏感型(TTX-S)钠通道的活性降低了7-70倍,这些残基应该是JZTX-V结合TTX-S钠通道的关键残基。敬钊缨毛蛛毒素一Ⅸ(Jingzhaotoxin-Ⅸ,JZTX-Ⅸ)是从敬钊缨毛蛛毒液中分离鉴定到的一种新型神经毒素,由34个氨基酸残基组成,其中含6个半胱氨酸并形成叁对二硫键,C-端酰胺化。该毒素与从Ceratogyrus cornuatus中分离得到的Ccotoxin一工I工有高达82%的序列相似性。为了更好的了解结构与功能的关系,利用同源模建技术模建了JZTX-Ⅸ的叁维结构,该多肽分子为典型的ICK模体结构,分子中包含一段双链反平行β-折迭片。JZTX-Ⅸ能够与多种通道相互作用,包括电压门控钠通道(TTX-S和TTX-R)和Kv2.1通道。JZTX-Ⅸ能够引起TTX-S、TTX-R钠通道以及Kv2.1通道的激活曲线往去极化方向漂移约10 mV,而对TTX-S和TTX-R钠通道的半数稳态失活电压却没有影响。因为JZTX-Ⅸ能够加快通道尾电流的去激活速度,暗示JZTX-Ⅸ能够导致通道从激活状态往静息状态偏移。并且JZTX-Ⅸ对处于静息关闭状态的TTX-S、TTX-R钠通道以及Kv2.1通道均表现出非常高的亲和性。我们推测JZTX-Ⅸ是对通道亚型选择性比较低的通道调制剂,能够捕获电压敏感元件于静息状态。我们进一步检测了JZTX-IX对于钠通道亚型rNav1.4、hNav1.5和hNav1.7的影响,发现JZTX-IX对hNav1.7的亲和力是最高的(IC50值为110 nM)。钠通道定点突变实验表明Domain II上的His754、Phe813和Arg830是决定Nav1.7通道对JZTX-IX的敏感性的关键残基,证明JZTX-IX是通过结合于钠通道DII的钠通道位点4而与钠通道相互作用,是位点4毒素。钾通道定点突变实验表明S3-S4片段的Glu215、Phe274、Glu277、Gln284和Phe285是影响Kv2.1通道对JZTX-IX的敏感性的关键残基,并且Phe274和Phe285两个残基最为关键。JZTX-XI由34个氨基酸残基组成,其中含6个半胱氨酸并形成叁对二硫键。前期在大鼠心肌细胞上的钠通道研究发现,JZTX-XI可以抑制大鼠心肌细胞上的钠通道的峰值电流(IC50=1.25μM)。利用膜片钳技术鉴定了JZTX-XI对电压门控钠通道亚型的影响,我们发现JZTX-XI偏好作用于Nav1.5通道亚型(IC50值为0.44μM)。JZTX-XI能够引起Nav1.5通道的激活曲线往去极化方向漂移约10 mV,也能够导致Nav1.5通道的半数稳态失活电压往超极化方向漂移约8 mV。因为JZTX-XI能够加快Nav1.5通道尾电流的去激活,暗示JZTX-XI能够导致通道从激活状态往静息状态偏移。我们推测JZTX-XI是一个通道调制型毒素,能够捕获电压敏感元件于静息状态。JZTX-X由31个氨基酸残基组成,含6个半胱氨酸并形成叁对二硫键。利用膜片钳技术和电压钳技术鉴定了JZTX-X对电压门控离子通道的影响。JZTX-X能够抑制Kv4.2和Kv4.3通道,其IC50值分别是68 nM和210 nM。JZTX-X的抑制作用呈现时间依赖性并且这种抑制是可逆的。JZTX-X能够导致Kv4.2和Kv4.3通道电流-电压关系曲线往去极化方向漂移约10 mV,我们推测JZTX-X很有可能是通过与钾通道电压敏感元件相互作用从而抑制Kv4.2和Kv4.3通道。虎纹捕鸟蛛(Ornithoc tonus huwena)是在我国南方发现的具有很强毒性的大型蜘蛛,其粗毒能使昆虫和小型脊椎动物致死。虎纹捕鸟蛛毒素-XVI (Huwentoxin-XVI,HWTX-XVI)是从虎纹捕鸟蛛毒液中分离鉴定到的一种新型神经毒素,由39个氨基酸残基组成,其中含6个半胱氨酸并形成叁对二硫键。全细胞膜片钳显示,HWTX-XVI能够选择性抑制大鼠DRG细胞N-型钙通道(IC50-60 nM),而对大鼠DRG细胞上的钠、钾通道和其它钙通道亚型都没有明显影响。HWTX-XVI的抑制作用呈现时间依赖性并且这种阻断是可逆的。另外,HWTX-XVI对低电压刺激引起的大鼠输精管平滑肌收缩有明显的阻断作用。上述结果显示HWTX-XVI的分子靶标跟ω-conotoxins GVIA和MVIIA非常相似。腹腔注射HWTX-XVI对福尔马林诱导的大鼠急性炎性疼痛模型有很好的镇痛作用。肌肉注射HWTX-XVI对术后损伤模型的机械性疼痛及热板模型疼痛都有着明显的镇痛作用；而且动物模型在该毒素的高剂量作用下未观测到肌体震颤、运动失调等毒副作用。因此,考虑到N-型钙通道在疼痛传导中的重要作用,HWTX-XVI可能是具有治疗前景的镇痛药物的先导分子。运用全细胞膜片钳技术,我们研究了虎纹捕鸟蛛食道下神经节细胞电压门控离子通道的电生理和药理学特征。结果发现虎纹捕鸟蛛神经元上表达有多种离子通道,至少包括电压门控钙通道、TTX-S钠通道和两种类型的钾通道。它们的药理学特征表现出与哺乳动物的相似性。蜘蛛钙通道对两种众所周知的哺乳动物高电压激活钙通道抑制剂ω-conotoxin GVIA和diltiazem敏感。4-AP和TEA分别能够抑制蜘蛛神经元瞬时外向钾通道和延迟整流钾通道。HWTX-I和HWTX-IV是虎纹捕鸟蛛毒液中两种主要有毒成分。前期工作显示它们分别能够有效抑制哺乳动物神经元上高电压激活钙通道和TTX-S钠通道,然而它们对来自蜘蛛神经元的相应亚型却作用微弱。虎纹捕鸟蛛粗毒对其自身神经元延迟整流钾通道没有作用,并且只能微弱的抑制蜘蛛瞬时外向钾通道(IC5o-51.3mg/L)。我们推测0. huwena Nav DII S3-S4两个酸性残基Asp816和Glu818的取代很有可能是HWTX-IV对虎纹捕鸟蛛钠通道作用下降的主要原因。因此,我们的发现为研究蜘蛛在自我防御和捕猎机制中的离子通道进化提供了重要依据。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2010-05-01）
蔡丽君[7]（2010）在《敬钊缨毛蛛毒素-V与Kv4.3钾通道相互作用机制研究》一文中研究指出敬钊缨毛蛛毒素-V(Jingzhaotoxin-V, JZTX-V)是从我国新发现的珍稀蜘蛛品种敬钊缨毛蜘蛛(Chilobrachys jingzhao)粗毒中分离纯化到的一种新型肽类神经毒素,其相对分子质量为3605.73。以往的电生理试验表明JZTX-V对大鼠背根神经节细胞上表达的电压门控钙通道和延迟整流钾通道电流均没有抑制作用却能够部分抑制瞬时外向钾电流。进一步的研究发现JZTX-V对表达在非洲爪蟾卵母细胞上的瞬时外向钾通道Kv1.4和Kv4.1没有抑制作用,却能够完全抑制同样表达的瞬时外向钾通道Kv4.2。Kv4.3通道也属于瞬时外向钾通道,该钾通道亚型在调节心肌细胞动作电位的幅度与时程方面具有重要作用,是治疗心律失常的有效作用靶点,其特异性抑制剂具有开发成抗心律失常药物的医用价值,但目前世界上Kv4.3通道亚型的特异性抑制剂非常缺乏。本研究通过多肽固相化学合成的方法合成了JZTX-V以及JZTX-V的丙氨酸突变体。突变体经反相高效液相色谱(HPLC)分离纯化和基质辅助激光解析离子飞行时间质谱(MOLDI-TOF-MS)鉴定之后,我们运用双电极杆电压钳技术检测了JZTX-V及其丙氨酸突变体对表达在非洲爪蟾卵母细胞上的Kv4.3钾通道电流的抑制作用。实验结果表明JZTX-V能显着抑制Kv4.3钾通道电流,并且这种抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性,其半数有效抑制浓度(IC50值)为425.1 nM。JZTX-V还能够使通道的电流电压关系曲线和稳态失活曲线分别向去极化方向漂移大约29 mV和10 mV来改变钾通道亚型Kv4.3的动力学特征。突变体研究结果表明突变体W5A-JZTX-V对Kv4.3钾通道的抑制作用下降38倍,突变体E17A-JZTX-V和K27A-JZTX-V对Kv4.3钾通道的抑制作用略有增强,但其他11个单残基突变体与叁个剪切体(Y1,I29,I28I29)对Kv4.3通道的抑制作用均没有产生明显的影响。由此,可以推测JZTX-V分子中第五位的色氨酸氨残基是负责该毒素与Kv4.3通道发生相互作用的关键活性残基。鉴于单残基剪切体对通道的抑制作用没有明显改变,在对JZTX-V进行分子改造的时候,可以考虑将位于JZTX-V分子上第1位的酪氨酸残基和第29位的异亮氨酸残基剪切,以节省生产的成本。为了进一步探索JZTX-V与Kv4.3通道相互作用的分子机制,运用点突变的方法设计和构建了12个Kv4.3通道S1-S2片段和S3b-S4片段的胞外连接环上的单点突变体,为用膜片钳技术检测JZTX-V与Kv4.3通道发生相互作用的结合位点奠定了基础。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2010-05-01）
蔡丽君,曾雄智,梁宋平[8]（2009）在《敬钊缨毛蛛毒素-V对kv4.3通道的作用研究》一文中研究指出敬钊缨毛蛛毒素-V是用离子交换层析和反向高效液相色谱从海南敬钊缨毛捕鸟蛛Chilobrachys jingzhao粗毒中分离纯化到的新的多肽神经毒素,采用Edman降解气相蛋白质测序方法得到它的一级结构为YCQKWMTCDSKRACCEGLRCKLWCRKⅡ-NH2,经MALDI-TOF质谱分析,分子量为3605。JZTX-V能选择性的抑制kv4.3通道的电流,IC_(50)值为425nM,并且JZTX-V能使通道的激活电位向去极化方向漂移。而本研究室之前的膜片钳实验表明,JZTX-V能够抑制大鼠背根神经节(DRG)细胞上的河豚毒素不敏感型(TTX-R)以及河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道,具有开发成新型镇痛药物的前景。为进一步探索JZTX-V与kv4.3通道相互作用的关键残基,并在此基础上对JZTX-V作分子改造,使其只保留钠通道活性或只保留钾通道活性以提高它对通道作用的选择性,本研究通过多肽固相合成的方法对JZTX-V进行了丙氨酸扫描,成功合成了14个单突变体和3个剪切体,并用双电极杆电压钳技术检测了突变体和剪切体对表达在非洲爪蟾卵母细胞上表达的kv4.3通道电流的作用。结果显示W5A-JZTX-V对kv4.3的抑制作用下降了38倍,E17A-JZTX-V和K27A-JZTX-V增强了对kv4.3通道电流的抑制作用,另外11个突变体对通道电流的抑制作用没有发生显着变化。叁个剪切体对JZTX-V对kv4.3通道电流的抑制作用也没有产生显着的影响,但是双剪切体I28I29对JZTX-V对kv4.3通道电流的抑制作用的影响比单剪切体I29的要显着。由此,我们推测第五位的色氨酸残基在JZTX-V对kv4.3通道电流的抑制中起着重要的作用。同时,在对JZTX-V作分子改造的时候,我们可以将第1位的酪氨酸残基和第29位的异亮氨酸残基剪切掉,以节省生产的成本。(本文来源于《第九届中国生物毒素学术研讨会论文摘要》期刊2009-11-25）
赵立群[9]（2009）在《敬钊缨毛蛛多肽毒素基因的真核表达及功能研究》一文中研究指出敬钊缨毛蛛(Chilobrachys jingzhao)是近年在我国发现的又一蜘蛛物种,分布于广西及海南等地。它的毒液是由许多生物活性成分组成的复杂混合物。我们在敬钊缨毛蛛粗毒中得到两个多肽毒素分子敬钊毒素34(JZTX-34)和敬钊毒素-Ⅲ(JZTX-Ⅲ)。JZTX-34由35个氨基酸残基构成,JZTX-Ⅲ由36个氨基酸残基构成,两者都含有叁对半胱氨酸。为了对这两种毒素进行深入的研究,我们采用表达质粒pVT102U/α和酿酒酵母S78菌株构成的真核表达系统来表达这两个毒素。我们将敬钊缨毛蛛cDNA文库中编码两者成熟肽的核酸序列构建到pVT102U/α载体上进行分泌表达。表达的JZTX-34能够抑制大鼠DRG细胞上TTX-S型钠电流,IC_(50)值约为85nM,而对大鼠DRG细胞上TTX-R型钠电流没有影响。这种抑制可以在+120mV的强去极化刺激下消除。JZTX-34不影响该通道的激活动力学和失活动力学,也不影响其失活速率。但是,100nMJZTX-34能引起TTX-S钠通道的稳态失活曲线朝去极化方向漂移约10mV。这些结果表明JZTX-34可能是作用于哺乳动物感觉神经元钠通道,但其作用位点有待进一步研究。此外,由于JZTX-34前体肽序列末端含有酰胺化信号-RK,表达未能形成酰胺化修饰,这可能是表达的JZTX-34容易降解的原因。表达的JZTX-Ⅲ与天然的毒素在分子、构型和生理学活性上都一致。我们构建、表达了JZTX-Ⅲ的25个突变体并表达成功,但是产量差异很大。另外,通过对HWTX-Ⅺ的表达条件进行优化,使表达产量大为提高。通过这些表达,我们发现影响蜘蛛多肽毒素基因表达的因素很多,为以后的表达研究提供了参考依据。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2009-05-01）
陈金军[10]（2008）在《敬钊缨毛蛛毒素分子多样性和功能研究》一文中研究指出敬钊缨毛蛛是在我国海南岛发现的一种有毒蜘蛛。它的毒液由许多具有不同生物活性物质组成。为了更好地开发利用该生物资源,阐明敬钊缨毛蛛毒素分子多样性及其遗传进化机制是非常重要的。我们取敬钊缨毛蛛的毒腺建立cDNA文库,随机挑取单克隆进行测序,得到788个高质量的表达序列标签。这些表达序列标签去冗余后,得到356个唯一序列,其中包括271个单拷贝序列和85个多拷贝重迭序列。这些唯一序列的31.4%是编码分泌蛋白的,其中29.1%是富含半胱氨酸的多肽,此类多肽称之为胱氨酸结毒素(CKTs),以及2.3%的其他分泌蛋白序列;54.0%是与普通细胞蛋白相关的;还有14.6%的序列没找到相似的已知序列。所有鉴定到的序列提交GenBank,序列接入号为:EU233831-EU233934和FE530957-FE531203。蜘蛛粗毒中的胱氨酸结毒素是作用于各种离子通道的新型配体。对104个胱氨酸结毒素前体进行系统进化分析显示,这些毒素可以分为6个家族,以及19个低相似性序列构成的“孤儿”家族。为了进一步研究这些毒素家族的结构、功能和进化关系,我们分离纯化到10个分别来自各家族的毒素,对其进行电生理功能检测、结构建模比较、进化分析和丰度分析。实验结果显示这些毒素家族分属两种类型:孔道堵塞毒素和门控调制毒素。孔道堵塞毒素在粗毒中的含量比较多,在蜘蛛中分布较广。孔道堵塞的毒素作用靶点专一,而所作用的靶点在生物进化中也较保守。因此,这类毒素是进化中比较保守、产生比较早的一类。门控调制毒素所包含的分子种类很多,这是与通道多样化的调制位点共进化的结果。对这些多肽毒素系统研究有可能为深入的药理学应用和研究提供大量的分子模板。另一方面,对普通细胞蛋白相关的转录子进行的基因注释揭示了一些新的可能的毒素成分和毒囊重要细胞生理过程的相关成分,比如蛋白翻译后修饰,细胞运动,蛋白质合成,能量供应等等。敬钊缨毛蛛毒腺的转录组分析和基因的注释编目展示了毒腺这个特化的产毒器官中的生理概况。敬钊毒素—Ⅲ(JZTX-Ⅲ)是来自于敬钊缨毛蛛的一个通过电压门控调制来抑制心肌钠通道的毒素。与β-蝎毒素不同的是,它使通道激活电压朝去极化方向漂移约10 mV,推测其结合位点可能为位点4。JZTX-Ⅲ展示了其对电压门控心肌钠通道亚型高亲和力和高选择性,使之有希望成为研究心肌钠通道的有力工具。然而,该分子与钠离子通道作用的活性表面还不得而知。为此,本课题中我们成功表达了JZTX-Ⅲ,表达的毒素与天然的毒素在分子、构型和生理学活性上都一致。于是,对其进行丙氨酸扫描,继续表达JZTX-Ⅲ的20个单残基由丙氨酸取代的突变体。其中一个突变体未能表达成功。用膜片钳实验一一检测突变体在表达于HEK293细胞上的Nav1.5对电流的作用。实验表明,13个突变体对抑制Nav1.5电流的浓度依赖性的改变很小,有6个突变体对此影响较大,有一个甚至无法检测到活性。突变体实验证明其活性表面是由疏水氨基酸和酸性氨基酸组成,而碱性氨基酸的突变对毒素抑制Nav1.5通道电流的活性影响不大。而且,当13位的精氨酸突变为谷氨酸时,其抑制Nav1.5的IC_(50)值为31.9nM,其活性是野生型JZTX-Ⅲ的十倍。在JZTX-Ⅲ的叁维结构图上描出这些关键残基,疏水性残基在一个面上形成一个疏水面,两个酸性残基处于N端,在疏水面的相对面。从以上结果确定了JZTX-Ⅲ这个门控调制毒素专一作用于Nav1.5的分子活性表面,提示JZTX-Ⅲ在与心肌钠通道结合时采取的是一种被称为Voltage Sensor Trapping的模式,利用其疏水面结合于心肌钠通道DomainⅡ区域,而其另一面的带电荷残基,特别是Asp1和Glu3利用电性引力捕获钠通道的富含碱性氨基酸残基的电压敏感区域即S4片段,从而影响钠通道的开放。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2008-11-01）
敬钊缨毛蛛毒素论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
蜘蛛所产生的具有生物活性的多肽毒素,可以选择性地作用于不同的靶标分子,例如电压门控钠离子通道。正是因为蜘蛛多肽毒素具有作用高效性和专一性的特点,故可以用来进行药理学实验研究和药物研究开发实验,同时也可以用作研究其靶标分子结构和功能的工具试剂分子。敬钊缨毛蛛是一类地下穴居的原始蜘蛛,隶属狒蛛科、棒刺蛛亚科、缨毛蛛属,是近年在我国发现的一蜘蛛新种。从其粗毒中分离纯化得到的29个氨基酸残基构成的多肽毒素--敬钊缨毛蛛毒素V,能够有效抑制大鼠背根神经节(ratDRG)上的河豚毒素敏感型和不敏感型电流,其半有效抑制浓度分别为30.2nM和27.6nM。首先,在本课题中,我们深入地研究了敬钊缨毛蛛毒素V的结构和功能,证明了其是一种作用于电压门控钠离子通道亚型Nav1.4的强抑制剂,其对Nav1.4的半有效抑制浓度为5.12nM,强于其对大鼠背根神经节(ratDRG)上的河豚毒素敏感型和不敏感型电流的抑制作用。在对其电压门控钠离子通道亚型选择性的筛选研究过程中,我们选用了四种电压门控钠离子通道亚型,分别为Nav1.3,Nav1.4,Nav1.5和Nav1.7。实验结果表明JZTX-V对Nav1.4的抑制作用最强,而对Nav1.5的抑制作用最弱,其半有效抑制浓度分别为：hNav1.3,292±61nM；rNav1.4,5.12±0.87nM,hNav1.5,2.7±0.779μM和hNav1.7,61.7±1.2nM,同时拟合得出的时间常数值为34.01±6.81s(rNav1.4),133.33±27.96s(hNav1.7),48.54±11.35s(hNav1.3)和34.24±8.13s(hNav1.5),此实验结果可以证明敬钊缨毛蛛毒素V能够高效且快速地作用于电压门控钠离子通道亚型Nav1.4。敬钊缨毛蛛毒素V(JZTX-V)可以有效地抑制Nav1.4的峰电流值,但是在其亚饱和浓度时,敬钊缨毛蛛毒素V对于Nav1.4的稳态激活和稳态失活都无明显作用,但是却可以改变稳态激活和稳态失活曲线的中点斜率。接下来,我们通过化学合成的敬钊缨毛蛛毒素V的单点突变体来研究其和Nav1.4相互作用的生物学活性位点。研究结果表明,一方面,和野生型的敬钊缨毛蛛毒素V相比,叁个疏水性残基(W5,M6和W7)的甘氨酸单点突变体可以显着地降低敬钊缨毛蛛毒素V对Nav1.4的峰电流抑制作用。通过希尔方程拟合后,可以得出不同的敬钊缨毛蛛毒素V单点突变体对钠离子通道亚型Nav1.4的半有效抑制浓度为0.313±0.26(W5A),0.252±0.45(M6A)和1.92±0.31(W7A)μM。和野生型的敬钊缨毛蛛毒素V相比,其半有效抑制浓度分别提高了61(W5A),49(M6A)和375(W7A)倍。另一方面,和野生型的敬钊缨毛蛛毒素V相比,两个带正电荷的残基(R20和K22)的甘氨酸突变体可以显着降低敬钊缨毛蛛毒素V和Nav1.4的作用。通过希尔方程拟合后,可以得出不同的敬钊缨毛蛛毒素V单点突变体对钠离子通道亚型Nav1.4的半有效抑制浓度为2.1±0.28(R20A)和0.659±0.011(K22A)μM。和野生型的敬钊缨毛蛛毒素V相比,其半有效抑制浓度分别提高了410(R20A)和128倍(K22A)。由此可知,敬钊缨毛蛛毒素V具有两个生物学活性表面,其中一个为疏水性生物学活性表面,由叁个疏水性氨基酸残基组成(W5,M6和W7)；而另一个生物学活性表面由带正电荷氨基酸的残基所组成(R20和K22)。根据其同源模建的结构来看,敬钊缨毛蛛毒素V的带正电荷生物学活性表面位于其疏水性生物学活性表面的周围。先前的关于敬钊缨毛蛛毒素V的磷脂实验表明,敬钊缨毛蛛毒素V表面的带正电荷的氨基酸残基有可能参与到毒素和离子通道的结合过程当中,这一点在本实验中得到验证。关于敬钊缨毛蛛毒素V和电压门控钠离子通道的关键位点研究结果表明,在我们突变的61个氨基酸残基中,其包括所有位于电压门控钠离子通道亚型Navl.4的不同的结构域的不同的胞外连接环,并没有鉴定到对JZTX-V的抑制作用改变特别明显的单点突变体,由此可以知道JZTX-V不作用于电压门控钠离子通道Nav1.4的胞外连接环上。其次,本论文还研究了β1亚基是否在敬钊缨毛蛛毒素V和Nav1.4的相互作用中起到一定的作用。研究结果表明,首先,β1亚基可以明显调节表达于HEK293细胞上的Nav1.4的动力学特征。再次,我们研究发现β1亚基可以降低敬钊缨毛蛛毒素V和电压门控钠离子通道亚型Nav1.4的亲和性,也就是说,β1亚基可以阻碍敬钊缨毛蛛毒素V和Nav1.4的作用。再次,本论文还研究了导致低血钾周期性麻痹疾病的单点突变Nav1.4R222W的离子通道动力学特征,研究结果表明,和野生型的钠离子通道Navl.4相比,导致低血钾周期性麻痹疾病的单点突变Nav1.4R222W可以使激活曲线向去极化方向漂移近6mV；这一单点突变体还可以使失活曲线向超极化方向漂移近5mV。这些在离子通道动力学方面的改变,可也加强钠离子通道Nav1.4的失活作用,导致在静息电位下可激活的钠离子通道数目的减少,以至于无法爆发足够的动作电位,最终导致肌肉的麻痹。据临床报道,临床常用药物乙酰脞胺对此类患者毫无疗效,乙酰脞胺的药理作用为改变细胞外的pH值。但是根据我们的研究,这种导致低血钾周期性麻痹疾病的单点突变Nav1.4R222W和之前发现的此类疾病的单点突变体所不同的是,这类突变体对胞外pH值得变化不敏感,其胞外pH值的变化对其无任何调节作用,由此导致药物乙酰脞胺的对此类患者无任何治疗效果。我们的研究结果解释了为什么突变体Nav1.4R222W会导致低血钾周期性麻痹以及为什么药物乙酰脞胺的对此类患者无疗效。综上所述,我们的研究实验数据表明,和Nav1.4相关单点突变体可以导致严重肌肉疾病的发生,以及敬钊缨毛蛛毒素V是一种可以高效且快速作用于Nav1.4的多肽分子抑制剂,一方面,为研究电压门控钠离子通道的结构和功能提供了一个新的分子试剂,另一方面也为肌肉疾病类药物的开发提供了一个先导分子。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
敬钊缨毛蛛毒素论文参考文献
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[3].张立钊.敬钊缨毛蛛毒素-V对治疗CCI大鼠神经病理性疼痛的研究[D].中南大学.2014
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[10].陈金军.敬钊缨毛蛛毒素分子多样性和功能研究[D].湖南师范大学.2008
论文知识图
