基于小分子介导DNA信号放大的荧光分析方法研究

论文摘要

信号放大是实现灵敏分析的有效途径,DNA因为具有独特的碱基互补配对特性以及可化学合成的简便性已成为信号放大的良好材料。DNA信号放大已被广泛应用于生物分子的灵敏分析检测。本论文从小分子介导DNA信号放大角度出发,通过酰胺键的形成、点击化学以及腙化学实现了小分子介导的DNA杂交链反应（HCR）与DNA行走（DNA Walker）,构建了两种新型的荧光分析方法,分别用于葡萄糖苷酶及其抑制剂的分析和脂多糖（LPS）及糠醛的检测。主要研究内容如下:1.酶底物介导的DNA杂交链反应原位检测α-葡萄糖苷酶活性及抑制剂筛选新方法论文本部分提出了一种基于小分子介导DNA杂交链反应（HCR）的α-葡萄糖苷酶（α-Glu）及其抑制剂的原位分析新方法。作为一种重要的消化酶,α-Glu可以催化底物对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pAPG）水解为对氨基苯（pAP）和α-D-吡喃葡萄糖苷。我们将pAPG共价连接至磁纳米球（AMNSS）上,其含有顺式二醇基团可以与硼酸标记的起始链形成磷酸二酯键,导致起始链被固定于AMNSS,进而驱动AMNSS周围HCR的发生。然而,催化反应产物pAP不具备捕获硼酸标记的起始链的能力,不能触发HCR。因此,α-Glu活性与AMNSS周围HCR反应程度的有关。在0.4 U/mL-1.7 U/mL浓度范围内,荧光强度与酶的活性呈现线性相关,最低检出限为0.023 U/mL。同时,所建立的方法也可用于没食子酸、槲皮素等酶抑制剂的筛选分析。另外,该方法还可以应用于细胞膜表面α-Glu的原位检测及细胞水平上抑制剂的筛选。2.基于裂开式行走链介导DNA Walker的构建及其在双靶标分析中的应用本部分提出并构建了基于裂开式行走链介导与叠氮-炔环加成反应以及腙化学的结合联用的DNA Walker,并将其应用于分析脂多糖（LPS）和糠醛。该方法是通过两个反应体系完成的。在第一反应体系中,磁珠（MB）因其表面带有链霉亲和素可以与末端修饰生物素的脂多糖适体链结合,而识别链DNA通过碱基互补配对与适体链结合。在第二反应体系中,MB通过链霉亲和素-生物素高亲和力分别结合两种末端分别修饰肼以及二苯并环辛炔的长链DNA,及两种与识别链互补的末端修饰不同荧光基团的短链DNA。在第一反应体系中加入含有不同浓度的脂多糖和糠醛,脂多糖与适体链竞争性结合,导致修饰有叠氮基团的识别链的游离。将其移入第二反应体系中,同时加入可以与糠醛竞争反应的醛基修饰的识别链,两种识别链分别通过点击化学和腙化学与长链DNA结合,从而与短链DNA形成碱基的互补配对。在切割酶存在的情况下,短链末端被不断的切割,DNA Walker不断地进行,致使溶液中荧光信号被不断放大。在单靶标检测DNA Walker体系中,在10-44 ng/mL到107 ng/mL浓度范围内,脂多糖与荧光信号强度呈现线性相关,其最低检测限为91 fM,该体系展示了高灵敏性,并可应用于脂多糖的实际样品分析。而在在双靶标检测DNA Walker体系则可对对脂多糖与糠醛进行定量分析,其中脂多糖的线性检测范围为10-22 ng/mL-107ng/mL,糠醛的线性检测范围为1μM-50 mM。该方法实现了脂多糖与糠醛的检测,有重要的应用前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 小分子介导化学反应的概述
•     1.1.1 叠氮-炔环加成点击化学
•     1.1.2 腙化学
•     1.1.3 硼酸识别
•   1.2 DNA信号放大的概述
•     1.2.1 DNA杂交链反应（HCR）
•     1.2.2 DNA Walker
•   1.3 荧光分析方法简介
•     1.3.1 有机物的荧光分析
•     1.3.2 无机元素的荧光分析
•   1.4 本论文的主要研究内容及意义
• 第二章 酶底物介导的DNA杂交链反应原位检测α-葡萄糖苷酶活性及抑制剂筛选新方法
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料与方法
•     2.2.1 试剂与仪器
•     2.2.2 自组装磁纳米球（AMNSs）的制备
•     2.2.3 AMNSs的修饰
•     2.2.4 对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p APG）介导的磁表面杂交链反应
•     2.2.5 不同修饰状态的AMNSs的表征
•     2.2.6 抗干扰分析
•     2.2.7 细胞培养
•     2.2.8 分子水平及细胞水平酶活性分析
•     2.2.9 酶抑制剂分析
•     2.2.10 统计分析
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 pAPG介导的杂交链反应
•     2.3.2 酶分析方法的机理研究
•     2.3.3 抗干扰能力评价
•     2.3.4 重组α-葡萄糖苷酶（α-Glu）及其抑制剂检测
•     2.3.5 细胞膜上α-Glu及其抑制剂检测
•   2.4 结论
• 第三章 基于裂开式行走链介导DNA Walker的构建及其在双靶标分析中的应用
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料与方法
•     3.2.1 试剂与仪器
•     3.2.2 脂多糖适体链和识别链修饰的磁珠（MB-LPSA/L1'）的制备
•     3.2.3 单靶标检测DNA Walker体系的构建
•     3.2.4 双靶标检测DNA Walker体系的构建
•     3.2.5 MB-LPSA/L1'及DNA Walker体系的表征
•       3.2.5.1 DNA Walker的聚丙烯酰胺电泳（PAGE）电泳表征
•       3.2.5.2 MB-LPSA/L1'的表征
•       3.2.5.3 脂多糖诱导的链解离的表征
•       3.2.5.4 叠氮-炔环加成反应的表征
•       3.2.5.5 腙化学及糠醛竞争性反应的验证
•       3.2.5.6 叠氮-炔环加成反应与腙化学同时反应的表征
•     3.2.6 单靶标检测DNA Walker体系检测L1'
•     3.2.7 单靶标检测DNA Walker体系检测脂多糖
•       3.2.7.1 脂多糖的定量检测
•       3.2.7.2 脂多糖的特异性分析
•       3.2.7.3 实际样品中脂多糖的检测
•     3.2.8 双靶标检测DNA Walker体系检测脂多糖与糠醛
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 MB-LPSA/L1'的验证
•     3.3.2 单靶标检测DNA Walker体系中叠氮-炔环加成反应的验证
•     3.3.3 DNA Walker体系的PAGE验证
•     3.3.4 单靶标检测DNA Walker体系的DNA链比例及时间优化
•     3.3.5 单靶标检测DNA Walker体系检测L1'链
•     3.3.6 单靶标检测DNA Walker体系检测脂多糖
•       3.3.6.1 脂多糖的定量检测
•       3.3.6.2 脂多糖的特异性检测
•       3.3.6.3 实际样品中脂多糖的检测
•     3.3.7 单靶标检测DNA Walker体系检测糠醛
•       3.3.7.1 糠醛的定性检测
•       3.3.7.2 糠醛检测的条件优化
•     3.3.8 双靶标检测DNA Walker体系检测脂多糖与糠醛
•       3.3.8.1 双靶标检测DNA Walker体系的验证
•       3.3.8.2 双靶标检测 DNA Walker 体系的定性研究
•       3.3.8.3 双靶标检测 DNA Walker 体系的条件优化
•       3.3.8.4 双靶标检测 DNA Walker 体系分析脂多糖与糠醛
•   3.4 结论
• 第四章 总结和展望
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文及专利
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 岳禧泉

导师: 张娟

关键词: 小分子介导化学反应,杂交链反应,荧光分析,腙化学,点击化学

来源: 上海大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 上海大学

分类号: O657.3;Q523

DOI: 10.27300/d.cnki.gshau.2019.000375

总页数: 79

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