嗜热菌Anoxybacillus来源的α-淀粉酶的酶学性质分析及其热定性改造研究

论文摘要

不同生境中各具特性酶的挖掘,一方面要满足不同的应用条件对酶的催化活性、酸碱耐受性、热稳定性、氧化稳定性、有机溶剂耐受性、立体异构选择性等的特定要求;另一方面则丰富和扩展人们对酶的各种机制的认识,以便能更好地开发甚至创造符合要求的酶。Anoxibacillus sp.主要分布于火山温泉、堆肥等热环境中,为嗜热碱性菌,相应地,来源于Anoxybacillus sp.的蛋白,具有耐热和嗜碱的特性,这使Anoxybacillus sp.成为重要的微生物资源,在生物质能源、环境污染物处理等方面发挥重要作用。本研究通过对来源于温泉环境的Anoxibacillus sp.GXS-BL的α-淀粉酶的生化特性的分析研究,发现Ca2+能提高该酶的热稳定性,Zn2+抑制其活性,在B结构域进行的突变改造降低其热稳定性和活性,由此进行的相关热力学、动力学等方面的机理分析研究,不仅有助于对该酶的认识和利用,获得的理论和实验认识,还可以用于指导其他工业酶的开发与应用。主要研究结果如下:采用淀粉作为单一碳源的M9培养基,从腾冲温泉土壤中筛选到产淀粉酶的菌株Anoxybacillus sp.GXS-BL,通过序列比对和基因步移扩增,获得该菌株的α-淀粉酶基因AGXA。将AGXA与表达载体pQE30连接,导入大肠杆菌M15中表达,对表达产物进行分离纯化和酶学性质分析。结果表明,AGXA对可溶性淀粉催化水解反应的最适反应pH为8.0,最适反应温度Topt为60 ℃,热半失活温度T50为63.3 ℃,熔解温度Tm为67.3 ℃,在70℃时的半衰期t1/2小于5min,是中等耐温碱性酶。Vmax、Km、Kcat、Kcat/tm分别为0.933×10-5 M.L-1.S-1、3.43 g.-1 2.54×102s-1、74.10 s-1g-1L;对有机溶剂和活性剂具有较强的耐受性。Na+、K+对AGXA有激活作用,Mg2+、Ca2+对该酶的活性影响不明显,Cu2+、Co2+、Fe3+明显抑制该酶的活性,Zn2+则完全抑制其活性。Ca2+提高AGXA的热稳定性。在Ca2+存在下,AGXA的最适反应温度Topt为70 ℃,AGXA的热半失活温度T50为73.8 ℃,在70 ℃时的半衰期t1/2大于200 min,熔解温度Tm 为77.8 ℃。圆二色性分析表明,在常温下,Ca2+的加入,并不改变AGXA的二级结构,只是使其结构更紧凑。在升温过程中,没有Ca2+的AGXA在60℃以内,维持着相对稳定的二级结构,随着温度的升高,二级结构逐渐改变,其结构变化主要发生在60-70℃范围内,到70 ℃后,结构变化结束;吸收信号值则随温度升高持续增大,表明蛋白在去折叠后聚集,但没有发生沉淀。加Ca2+后,AGXA的CD谱图发生变化的温度范围为70-80 ℃;吸收信号随温度升高先增大,然后下降,表明含Ca2+的AGXA在热去折叠后,先聚集后沉淀。差示扫描量热分析表明,有Ca2+的AGXA的热容变化发生在70℃,在77.8 ℃达最大值,热去折叠过程△H为164.7 kcal.M-1,热容变化值△Cp为1.35 kcal.M-1℃-1;不加Ca2+时,AGXA在60 ℃时热容升高,在67.3 ℃达最高,AH为133.0kcal.M-1,△Cp为1.83kcal.M-1℃-1。加Ca2+的AGXA通过增大热去折叠过程中的焓变化值△H、降低热容变化值△Cp来提高其热稳定性。Zn2+抑制AGXA的活性。金属离子对酶活性影响的实验表明,Zn2+与AGXA在40 ℃作用30 min后完全抑制其活性;圆二色性实验表明,Zn2+与AGXA作用后,酶的二级结构发生明显变化,不再具备原有的构型。采用量子化学方法,对组氨酸在蛋白质中的多重作用进行能量计算的结果表明,His-Zn2+形成的配位键能和阳离子-π相互作用能远远高于氢键和范德华相互作用能。采用分子动力学模拟,发现Zn2+不仅能与AGXA中保守的His217形成配位键,还能与Phe178形成阳离子-π相互作用,从而使Phe178的二面角C-CA-CB-CG维持在平面角构象,关闭AGXA的活性口袋,抑制其活性。对AGXA开展了不同温度的分子动力学模拟,结果表明,AGXA在400 K时的构象变化大于350 K的,氨基酸残基偏离平衡位置明显的主要在B结构域。根据350 K与300 K的△RMSF值,对AGXA进行热稳定性改造的突变位点选取;基于能量计算,对选取位点进行虚拟饱和突变分析,选取替换氨基酸;定点突变实验验证;发现D358I提高酶的热稳定性,在B结构域进行的其它突变改造降低酶的活性和热稳定性。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 前言
•   1.1 α-淀粉酶的简介
•     1.1.1 α-淀粉酶、α-淀粉酶家族和糖苷水解酶
•     1.1.2 α-淀粉酶的结构和催化机制
•   1.2 微生物来源的α-淀粉酶的热稳定性研究
•     1.2.1 嗜热菌与嗜热酶
•     1.2.2 嗜热酶的特征
•     1.2.3 蛋白质的热稳定性类型和研究方法
•       1.2.3.1 蛋白质的热稳定性类型
•       1.2.3.2 蛋白质的热稳定性研究方法
•     1.2.4 a-淀粉酶的热稳定性特征研究
•       1.2.4.1 不同来源的a-淀粉酶具有不同的热稳定性
•       1.2.4.2 a-淀粉酶的B结构域和A、B结构域交界处与热稳定性相关
•       1.2.4.3 α-淀粉酶的B结构域
•       1.2.4.4 氨基酸组成和其他的结构特征
•   1.3 蛋白质工程进行酶热稳定性改造的研究进展
•     1.3.1 定向进化
•     1.3.2 理性改造
•       1.3.2.1 序列驱动的改造
•       1.3.2.2 基于结构的改造
•       1.3.2.3 稳定性预测
•   1.4 Anoxyballus sp.的研究概况
•     1.4.1 嗜热菌Anoxybacillus sp.的发现和分类
•     1.4.2 Anoxybacillus sp.来源的α-淀粉酶的研究
•   1.5 本论文的研究工作
•     1.5.1 研究目的与意义
•     1.5.2 主要研究内容
•     1.5.3 研究思路
• 第二章 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 菌株及质粒
•     2.1.2 酶、药品、试剂和器材
•       2.1.2.1 实验用酶
•       2.1.2.2 主要药品
•       2.1.2.3 主要试剂和器材
•     2.1.3 仪器和设备
•     2.1.4 计算机硬件配置
•     2.1.5 主要培养基
•     2.1.6 主要引物
•     2.1.7 主要生物信息学工具和分析软件
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 细菌总DNA的提取
•     2.2.2 细菌质粒提取
•     2.2.3 凝胶回收纯化
•     2.2.4 DNA纯化
•     2.2.5 DNA的酶切、连接体系
•     2.2.6 DNA的电泳及DNA片段浓度测算
•     2.2.7 质粒DNA的转化
•     2.2.8 SDS-PAGE蛋白质电泳
•     2.2.9 蛋白质浓度测定
•     2.2.10 产淀粉酶菌株的筛选和鉴定
•       2.2.10.1 产淀粉酶芽孢杆菌的筛选
•       2.2.10.2 产淀粉酶菌株的鉴定
•       2.2.10.3 进化树构建
•     2.2.11 α-淀粉酶基因的克隆和表达质粒构建
•     2.2.12 重组α-淀粉酶的表达、纯化和蛋白质浓度测定
• 2+和含Ca²⁺的α-淀粉酶AGXA的制备'>    2.2.13 无Ca²⁺和含Ca²⁺的α-淀粉酶AGXA的制备
•     2.2.14 α-淀粉酶的活性分析
•     2.2.15 圆二色谱分析
•     2.2.16 差示扫描量热分析
•     2.2.17 a-淀粉酶的同源建模和序列结构分析
•     2.2.18 分子动力学模拟
• 2+对AGXA的热稳定性影响'>    2.2.19 Ca²⁺对AGXA的热稳定性影响
• 2+抑制AGXA的活性'>    2.2.20 Zn²⁺抑制AGXA的活性
•     2.2.21 酶的热稳定性改造
• 第三章 实验结果
•   3.1 产淀粉酶菌株的筛选和鉴定
•     3.1.1 产淀粉酶菌株的筛选
•     3.1.2 产淀粉酶菌株的鉴定
•       3.1.2.1 细菌总DNA提取纯化
•       3.1.2.2 16S rDNA PCR 扩増及纯化
•       3.1.2.3 16S rDNA基因的序列比对及构建系统发育树
•   3.2 α-淀粉酶基因的克隆、表达和纯化
•     3.2.1 a-淀粉酶基因的克隆和分析
•     3.2.2 表达质粒的构建，蛋白的表达和纯化
•   3.3 a-淀粉酶AGXA的酶学性质
• 2+的AGXA的酶学性质'>    3.3.1 无Ca²⁺的AGXA的酶学性质
• 2+对AGXA的热稳定性的影响'>    3.3.2 Ca²⁺对AGXA的热稳定性的影响
•   3.4 AGXA的圆二色性分析
•     3.4.1 AGXA在常温下的二级结构
•     3.4.2 AGXA的变温测定
•   3.5 AGXA的差示扫描量热分析
•   3.6 AGXA的同源建模和结构分析
•     3.6.1 AGXA的同源建模
•       3.6.1.1 模板搜索与选取
•       3.6.1.2 使用Modeller构建目标序列的3D模型
•       3.6.1.3 模型评估
•     3.6.2 AGXA的模型结构分析
•   3.7 AGXA的分子动力学模拟
• 2+抑制AGXA活性的研究'>  3.8 Zn²⁺抑制AGXA活性的研究
• 2+对AGXA活性的影响'>    3.8.1 Zn²⁺对AGXA活性的影响
• 2+与AGXA相互作用的CD分析'>    3.8.2 Zn²⁺与AGXA相互作用的CD分析
•     3.8.3 组氨酸在蛋白质中的多重作用
• 2+与AGXA相互作用的分子动力学模拟'>    3.8.4 Zn²⁺与AGXA相互作用的分子动力学模拟
•   3.9 AGXA的热稳定性改造
•     3.9.1 突变位点的选取
•     3.9.2 虚拟氨基酸突变分析
•     3.9.3 突变实验
•     3.9.4 突变酶的酶学性质分析
• 第四章 讨论
•   4.1 AGXA为中等耐温的新型碱性α-淀粉酶
• 2+提高AGXA的热稳定性'>  4.2 Ca²⁺提高AGXA的热稳定性
• 2+抑制AGXA的活性'>  4.3 Zn²⁺抑制AGXA的活性
•   4.4 AGXA的热稳定性改造研究
•     4.4.1 突变位点选取
•     4.4.2 替换氨基酸的选择
• 第五章 结论与创新
•   5.1 结论
•   5.2 创新
•   5.3 展望
• 参考文献
• 附录
•   附录一 蛋白纯化用缓冲液
•   附录二 基因和氨基酸序列
•   附录三 Amber14计算的部分文件
•   附录四 用Gaussian 09计算的部分文件
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文和研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 廖思明

导师: 黄日波

关键词: 淀粉酶,组氨酸,苯丙氨酸,酶活性,热稳定性,分子动力学模拟

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 广西大学

分类号: Q936

总页数: 162

文件大小: 14405K

下载量: 168