t10,c12-共轭亚油酸的特异性生物合成及其对SD大鼠乳腺肿瘤的抑制作用

论文摘要

共轭亚油酸（Conjugate linoleic acid,CLA）具有抑制肿瘤、抗动脉粥样硬化、减肥、降低胰岛素抵抗和降血糖、抗氧化以及降血压等生理功能,主要存在于反刍动物肉、奶及其制品中,但含量非常低。乳腺癌是威胁女性健康的头号杀手,是女性发病率和死亡率最高的疾病,体内和体外研究均证实CLA对乳腺肿瘤具有抑制作用。现有生产CLA的方法有化学法和生物法,化学法制备的CLA产物组成复杂、分离提纯困难,且一些异构体的安全性尚不明确;生物技术途径获得的CLA异构体组成相对简单,但也存转化率低、产物不单一等问题。本文从瘤胃中筛选出一株产t10,c12-CLA的菌株Propionibacterium acidipropionici Lx1,通过透性化和固定化处理提高该菌株产t10,c12-CLA的能力,并探究了t10,c12-CLA对DMBA诱导的SD大鼠乳腺肿瘤的抑制效果,主要实验结果如下:（1）从瘤胃中筛选出一株产t10,c12-CLA的菌株,在39℃条件下以1 g/L乳化亚油酸（Linoleic acid,LA）为底物转化24 h,其转化率为31.2%。通过生理生化实验以及16S rDNA鉴定该菌株为丙酸丙酸杆菌,命名为Propionibacterium acidipropionici Lx1,GenBank数据库登录号为MK050541。（2）以t10,c12-CLA产量为评价指标,通过单因素实验以及响应面法对P.acidipropionici Lx1的透性化条件进行优化。单因素实验得到的最佳透性化条件为:CTAB浓度为1.5%（w/v）,透性化温度37℃,时间60 min,透性化pH为5.8。在此条件下对P.acidipropionici Lx1进行透性化处理后,pH5.8的PBS缓冲液中以1.0 g/L乳化LA为底物39℃转化12 h得到t10,c12-CLA的产量为712.7mg/L。响应面进一步优化得到的最佳透性化条件为:CTAB浓度1.9%（w/v）,透性化时间56.5 min,温度31℃,pH5.8。在此条件下对P.acidipropionici Lx1进行透性化处理后,pH5.8的PBS缓冲液中1.0 g/L乳化LA为底物39℃转化12h得到t10,c12-CLA的产量为741.3 mg/L。透性化后的菌体细胞膜结构发生变化,通透性增加,整体结构保持完整,可用于发酵转化。（3）以t10,c12-CLA产量为评价指标对菌株固定化条件进行优化,单因素实验得到了固定化最佳条件为海藻酸钠浓度20.0 g/L,氯化钙浓度30.0 g/L,固定化时间60 min,菌体浓度1.05×10100 CFU/mL;响应面法优化固定化条件,得出海藻酸钠浓度25.0 g/L,氯化钙浓度40.0 g/L,固定化时间52.0 min,PBS缓冲液中1.0 g/L乳化LA为底物39℃转化12 h得到t10,c12-CLA的产量为726.3mg/L。对固定化菌株转化能力进行测定得到在优化后的固定化条件下菌体转化48 h后t10,c12-CLA产量达到851.7 mg/L,转化率为85.2%,固定化菌体能够在PBS缓冲液中重复使用6次。（4）五周龄SD大鼠50 mg/kg的DMBA每周灌胃一次,连续灌胃三周,76天后所有大鼠均成瘤,成瘤率100%。在DMBA诱导肿瘤的同时给予大鼠0.5g/kg的t10,c12-CLA每两天一次灌胃处理可显著延长肿瘤的潜伏期,但肿瘤形成后期肿瘤的重量和体积并没有显著性差异。对肿瘤组织HE染色和免疫组化分析得出,t10,c12-CLA对DMBA诱导的SD大鼠乳腺肿瘤的发展有一定的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 第1章 绪论
•   1.1 CLA的研究现状
•   1.2 CLA的生理功能
•     1.2.1 抑制肿瘤
•     1.2.2 减肥
•     1.2.3 降低胰岛素抵抗和降血糖
•     1.2.4 抗动脉粥样硬化
•     1.2.5 消炎等其他作用
•   1.3 CLA的制备
•   1.4 研究工作的意义及内容
•     1.4.1 课题来源
•     1.4.2 课题研究工作的意义
•     1.4.3 主要研究内容
• 第2章 瘤胃中产t10,c12-CLA菌株的筛选与鉴定
•   2.1 前言
•   2.2 材料与试剂
•     2.2.1 试剂
•     2.2.2 设备
•     2.2.3 培养基
•   2.3 方法
•     2.3.1 菌株的分离筛选
•     2.3.2 菌株的生理生化鉴定
•     2.3.3 分子生物学鉴定
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 t10,c12-CLA标准曲线的绘制
•     2.4.2 产t10,c12-CLA菌株的筛选
•     2.4.3 菌种的鉴定
•   2.5 本章小结
• 第3章 P.acidipropionici Lx1 生物合成t10,c12-CLA透性化条件的优化
•   3.1 前言
•   3.2 材料
•     3.2.1 菌株
•     3.2.2 试剂与设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 主要试剂及培养基的配置
•     3.3.2 菌种的复苏活化
•     3.3.3 菌种的培养
•     3.3.4 菌体的透性化
•     3.3.5 t10,c12-CLA的提取
•     3.3.6 透性化单因素条件的优化
•     3.3.7 透性化条件的响应面法优化设计
•     3.3.8 统计方法
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 透性化工艺参数的单因素分析
•     3.4.2 响应面分析法（RSM）透性化条件的优化
•     3.4.3 透性化菌株SEM观察
•   3.5 本章小结
• 第4章 透性化菌体固定化条件的优化
•   4.1 引言
•   4.2 材料
•     4.2.1 菌株
•     4.2.2 试剂与设备
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 主要试剂及培养基的配置
•     4.3.2 菌种的活化及培养
•     4.3.3 菌体的固定化
•     4.3.4 固定化条件的优化
•     4.3.5 固定化条件的响应面法优化设计
•     4.3.6 固定化菌株转化能力的测定
•     4.3.7 t10,c12-CLA的分析
•     4.3.8 统计方法
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 固定化条件单因素分析
•     4.4.2 固定化条件的响应面法（RSM）优化
•     4.4.3 转化时间对t10,c12-CLA产量的影响
•     4.4.4 LA浓度对转化率的影响
•     4.4.5 固定化菌株重复使用次数的测定
•   4.5 本章小结
• 第5章 t10,c12-CLA对乳腺肿瘤的抑制
•   5.1 引言
•   5.2 材料
•     5.2.1 SD大鼠
•     5.2.2 试剂与设备
•   5.3 实验方法
•     5.3.1 DMBA溶液
•     5.3.2 SD大鼠乳腺肿瘤模型的建立
•     5.3.3 肿瘤组织HE染色
•     5.3.4 免疫组化检测
•     5.3.5 统计方法
•   5.4 结果与讨论
•     5.4.1 大鼠体重变化及肿瘤生长
•     5.4.2 HE染色及免疫组化检测
•   5.5 本章小结
• 第6章 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 创新点
•   6.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张凯强

导师: 刘晓华

关键词: 丙酸丙酸杆菌,生物转化,透性化,固定化,乳腺肿瘤

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,肿瘤学

单位: 南昌大学

基金: 江西省重点研发计划项目(20171BBE50033)

分类号: Q936;R737.9

DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.000680

总页数: 72

文件大小: 3233K

下载量: 77