利用表面增强拉曼光谱检测无标记DNA分子结构

论文摘要

DNA在人体内的主要存在方式有两种:一种是众所周知的DNA双螺旋结构,也就是B型DNA结构,它们存在于细胞核中,携带着第一部遗传密码,精准的碱基互补配对法则将遗传信息准确无误地传递给子代DNA,是人体内主要的遗传物质;另一种是位于细胞核外的端粒中,或一些核内表达基因的启动子区域,以及在细胞质中与某些蛋白结合在一起的DNA结构,这些DNA分子通常不以右手双螺旋结构存在,我们称其为非B型DNA,目前为止我们发现的非B型DNA种类多达十几种,本论文主要针对其中的四分子DNA i-motif,DNA G-四链体和发卡型结构进行表面增强拉曼光谱（SERS）分析。虽然早在1953年,沃森和克里克就发现了DNA的右手双螺旋结构,但检测核酸结构的研究课题一直都是人们关注的热点。在双链B型DNA的检测中我们常依赖于PCR扩增结合二代鸟枪法测序技术,以分析双链DNA所包含的碱基顺序和含量。而针对非B型DNA则有所不同,因其不同于B型DNA,没有来自于碱基顺序和含量的遗传信息,而是展现了依赖于其结构的重要生物功能。所以非B型DNA的检测主要是针对其拓扑折叠结构,X-射线晶体衍射（XRD）、核磁共振（NMR）技术就成为了主要的检测手段,但是DNA分子不同于其他有机小分子,其自然的拓扑折叠结构,受浓度、温度、和溶液环境以及盐离子等条件控制,所以这两种技术手段所需要的高纯度、高浓度样品及结晶过程,都使得检测方法耗时、耗力,并且极其昂贵。而一些其他简单测试方法,CD光谱、紫外等仅能提供简单的结构信息,不能作为主要手段去研究DNA分子结构的细节信息。SERS与上述方法相比,具有简单、灵敏、耗时短、痕量等诸多优点,而且继承自拉曼光谱的指纹图谱信息又能很好的对应核酸结构的细节信息,因此可以作为检测核酸的一种有效的手段,但是SERS应用到核酸检测领域存在着很多困难,本论文针对这些困难设计了新的方法,实现了对DNA分子空间结构的解析,包括以下四部分内容:a.我们建立了一种简单可靠的方法,通过SERS快速检测分析四分子DNA i-motif结构。我们尝试使用具有三个正电荷的铝离子来诱导银纳米颗粒的聚集,形成高质量的“热点”,从而产生高度可再现的SERS光谱。我们成功检测到DNA i-motif的结构特征,第一次实现了利用SERS光谱检测和分析DNA i-motif结构的形成。此外,基于SERS峰值相对强度量化DNA i-motif结构碱基对平面的数量,以期望评估结构的相对稳定性。该方法显著扩大了SERS应用的范围,使其不仅可用于单链DNA和单碱基的检测,还可以用于检测复杂的多分子DNA结构。b.利用我们开发的新方法能快速获得DNA G-四链体的结构信息。我们的方法具有极高的灵敏度和可重复性。实际上,我们首次发现了位于G-四分体平面上的dG和dA环呼吸振动峰的变化与其结构的相关性。此外,我们还获得了一系列清晰可见的G-四链体SERS谱带,找出了DNA G-四链体的特定的结构特征峰,如氢键、糖苷角和G-四分体层等。通过比较这些谱峰可详细分析DNA结构多态性。我们的实验结果表明:G-四链体（G-quadruplex）在铝离子为聚集剂引导产生的银纳米颗粒（Ag IANP）的表面上采用了适当的位置,从而增强了与G-quartet中的碱基和氢键相对应的那些SERS谱带的强度。因此,通过测量归属于Hoogsteen氢键的SERS谱带的相对强度,可以定量G-四链体中的层数和评估G-四链体的稳定性趋势。本研究为G-四链体的无标记表征提供了一种新方法,并为进一步研究不同DNA构象以及DNA分子与其配体之间的相互作用打下了良好的基础。c.在我们以铝离子为聚集剂,成功地建立了一种可靠、灵敏的SERS分析方法基础上,我们巧妙的设计了一条DNA序列,在特定碱基顺序下可以形成发卡型结构,从而实现了对DNA杂交事件的检测。而且通过对在959 cm-1处代表核苷酸脱氧核糖的SERS峰强度的归一化,揭示了碱基堆积的稳定性规律。这种归一化方法不仅被证明对发卡dsDNA中G-C含量的精确测定是有效的,而且利用该方法对双螺旋DNA的碱基错配的检测有较高的灵敏度和可靠性,可以清晰地观察到双螺旋DNA中碱基错配的情况,识别错配碱基的位置。d.在水溶液中引入二氯甲烷作为界面剂,对已有的SERS方法进行了改进,使其成为一种更新颖的检测长链双链DNA的方法。在新开发的方法中,由于金属纳米颗粒之间的空间增大,首次实现了对不同长度DNA链碱基含量的不加区分的定量测量。此外,针对BIGH3基因单碱基突变检测的实验,进一步证明了该方法在长的双链DNA中获取快速、准确信息的适用性。该方法在基因突变和临床研究中具有重要价值。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 DNA分子的简介
•     1.1.1 B-DNA
•     1.1.2 非B-DNA
•   1.2 拉曼光谱
•     1.2.1 拉曼光谱在核酸检测方面的应用
•     1.2.2 拉曼峰位归属
•     1.2.3 拉曼谱带强度
•   1.3 表面增强拉曼光谱（SERS）
•     1.3.1 表面增强拉曼光谱（SERS）的简介
•     1.3.2 表面增强拉曼光谱（SERS）在核酸检测方面的应用
•   1.4 本论文的选题与研究内容
•     1.4.1 本论文的选题
•     1.4.2 本论文的工作内容
•     1.4.3 论文研究意义
•   参考文献
• 第二章 利用表面增强拉曼光谱无标记检测四分子DNA I-MOTIF结构
•   2.1 前言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 DNA i-motif结构的制备
•     2.2.2 SERS光谱学
•     2.2.3 银溶胶制备
•     2.2.4 “热点”的产生
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 铝离子作为聚集所形成的高质量“热点”
•     2.3.2 DNA i-motif结构的形成
•     2.3.3 DNA i-motif在增强基底表面的取向
•     2.3.4 DNA i-motif的稳定性分析
•   2.4 结论
•   参考文献
• 第三章 利用表面增强拉曼光谱揭示DNA G-四链体的结构特征
•   3.1 引言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 Ag IANPs准备
•     3.2.2 SERS的样品制备
•     3.2.3 SERS光谱检测
•     3.2.4 质谱检测
•     3.2.5 CD光谱学
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 获得DNA G-四链体SERS信号
•     3.3.2 利用SERS分析G-四链体的形成
•     3.3.3 DNA G-四链体在增强基底表面的取向
•     3.3.4 不同类型的G-四链体的SERS光谱
•     3.3.5 利用SERS光谱对不同类型的G-四链体进行区分
•     3.3.6 G-四链体与B-DNA的 SERS光谱相似性
•     3.3.7 G-四链体的稳定性与G-四分体的量化信息
•   3.4 结论
•   参考文献
• 第四章 利用表面增强拉曼光谱对DNA杂交事件的检测
•   4.1 引言
•   4.2 实验部分
•     4.2.1 实验方法
•     4.2.2 Ag IANPs准备
•     4.2.3 SERS的样品制备
•     4.2.4 CD光谱学
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 利用SERS光谱检测DNA发卡型结构的形成
•     4.3.2 重新定义归一化峰位
•     4.3.3 利用SERS光谱检测DNA碱基对之间的错配
•   4.4 结论
•   参考文献
• 第五章 利用表面增强拉曼光谱检测基因突变
•   5.1 引言
•   5.2 实验部分
•     5.2.1 银纳米粒子的制备
•     5.2.2 SERS“热点”的制备
•     5.2.3 DNA样品制备
•     5.2.4 CD光谱学
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 二氯甲烷对“热点”的质量的优化
•     5.3.2 利用SERS定性识别DNA序列中各碱基峰位置
•     5.3.3 利用SERS定量识别不同长度DNA序列的碱基含量
•     5.3.4 利用SERS定性识别DNA杂交事件
•     5.3.5 利用SERS识别可遗传性基因突变
•   5.4 结论
•   参考文献
• 第六章 总结与展望
•   6.1 总结
•   6.2 展望
• 作者简历
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李洋

导师: 国新华

关键词: 表面增强拉曼光谱,四链体,碱基错配,基因突变

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 吉林大学

分类号: Q523;O657.37

总页数: 121

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