SYBR GreenⅡ黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR方法的建立

论文摘要

利用SYBR GreenⅡ染料法,建立黄芩实时荧光定量PCR的反应体系。根据18S rRNA基因序列保守性,在18S rRNA基因保守区设计一对特异性引物,以常规PCR产物为标准品,浓度梯度稀释后制定标准曲线,对溶解曲线进行分析,对PCR退火温度,引物浓度,模板浓度等反应条件进行优化。结果表明:在20μL反应体系中,加入10μL SYBR Premix Ex Taq TM时,引物和cDNA最佳加入量分别为0.8μL和1.0μL;最佳反应程序:进行40次循环,95℃预变性30 s,95℃变性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s。标准曲线Ct的检测范围在14～29,扩增效率为97.8%;溶解曲线显示为单峰,其Tm为(85±1.0)℃。本研究建立的黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR法,具有检测范围广,扩增效率高,特异性高等优点,对从分子水平阐明黄芩药效成分合成机制,筛选高产优质的黄芩种质资源具有重要的意义。

论文目录

• 1 结果与分析
•   1.1 q RT-PCR反应体系的优化
•   1.2 PCR扩增和目标条带回收和测序
•   1.3 目的片段溶解曲线分析
•   1.4 建立标准曲线
• 2 讨论
• 3 材料与方法
•   3.1 材料
•   3.2 引物设计与合成
•   3.3 总RNA的提取及反转录合成c DNA
•   3.4 18S rRNA基因目的片段扩增、克隆及鉴定
•     3.4.1 目的片段PCR扩增
•     3.4.2 连接与转化
•     3.4.3 阳性菌落PCR鉴定及测序
•   3.5 SYBR GreenⅡ荧光定量PCR方法的建立
•     3.5.1 标准品制备
•     3.5.2 q RT-PCR反应体系的优化
•       3.5.2. 1 循环条件的优化
•       3.5.2. 2 退火温度的优化
•       3.5.2. 3 引物浓度的优化
•       3.5.2. 4 标准曲线的建立

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 王帅,程林,杨利民,韩梅

关键词: 黄芩,内参基因,实时荧光定量

来源: 分子植物育种 2019年06期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,农作物

单位: 吉林农业大学中药材学院

基金: 国家自然科学基金项目(31570327,31070292)资助

分类号: S567.239;Q943.2

DOI: 10.13271/j.mpb.017.001965

页码: 1965-1969

总页数: 5

文件大小: 198K

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