杜邦嗜热菌两个转录因子及其调控的生物合成基因的研究

论文摘要

真菌蕴含丰富多样的天然产物生物合成基因和基因簇（Biosynthetic Gene Cluster,BGCs）,但是这些基因和基因簇在实验室条件下表量低或是不表达,导致被报道的真菌天然产物数量远低于预测BGCs数量的。目前研究多采用过表达正调控因子的方法来激活真菌次生代谢产物的生物合成,而关于负调控因子对真菌次生代谢产物影响的研究却鲜有报道。此外,在异源宿主中表达真菌中的沉默基因也是发掘和研究真菌次生代谢产物的有效方式。杜邦嗜热菌（Thermomyces dupontii2155）是一类从高温环境中分离鉴定的丝状真菌,前期本实验室从中分离得到一类色素类吲哚生物碱类化合物Talathermophilins和具有新颖结构且对线虫具有显著毒杀活性的大环内酯化合物Thermolides,并鉴定了 Thermolides的生物合成基因。进一步的研究发现该真菌中的大多数生物合成基因仍处于沉默状态,特别是该菌中唯一的Ⅰ型PKS-NRPS杂合基因（Talth1004980t1,TalA）其表达量在实验室培养条件下难以检测到。本论文依据前期T.duponti的转录组数据及生物信息学分析预测出TalA所在的基因簇上的转录抑制因子为Talthlp4005393（TF3）;根据文献报道的构巢曲霉中一个多基因簇的负调控因子McrA在杜邦嗜热菌中找到其同源基因Talth1p4001383。本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑系统对TF3和McrA这两个基因进行基因编辑从而研究这两个负调控基因对T.dupontii次生代谢产物合成的影响。首次选择重要的捕食线虫真菌少孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）作为异源宿主,异源表达TalA和其ER基因（Talth1p40031173）,探究TalA和ER基因的生物合成功能及作用。主要实验结果:1、运用CRISPR-Cas9基因编辑系统获得4个TF3和5个McrA基因突变菌株,分别为Δ TF3-18,Δ TF3-12,Δ TF3-21,Δ TF3-14和ΔmcrA-11,Δ mcrA-34,AmcrA-3,Δ mcA-15,Δ mcrA-12。在PDB培养条件下,4个TF3突变菌株的LC-MS图谱上均比WT多出多个差异峰,其中差异[M-H]-离子峰量为355.9968（13.20 min）,359.0084（20.50 min）,357.0000（10.60 min）,359.0869（16.00 min）,375.1307（16.50 min）;差异[M+H]+离子峰量为371.2268（]0.70 min）,388.2532（11.40 min）,379.3350（36.35 min）,并有多个峰面积增高。表明TF3是TalA基因簇上的转录抑制相关蛋白。两个McrA突变菌株ΔMrA-3和ΔMcrA-15与WT相比有多个峰面积增高。TF3突变菌株中的差异化合物值得进一步分离和鉴定。2、首次利用tRNAGly启动子在少孢节从孢中成功驱动sgRNA表达,初步建立CRISPR-Cas9基因编辑系统,获得一个成功编辑的菌株,Δ215g283-Cas9-1。LC-MS结果显示基因编辑菌株Δ215g283-Cas9-l和利用同源重组获得的基因敲除突变菌株Δ215g283的代谢图谱是一致的,表明CRISPR-Cas9基因编辑系统适用于少孢节从孢基因功能的研究。3、成功获得5个在少孢节从孢中表达嗜热真菌生物合成基因的异源表达菌株,分别为AO-TalA-1、AO-TalA-2、AO-TalA-ER-3、AO-TalA-ER-7和AO-TalA-ER-9。在PDB培养条件下,AO-TalA-1表达菌株与WT在HPLC图谱中出现7个差异峰,AO-TalA-ER-3,AO-TalA-ER-7,AO-TalA-ER 的HPLC和图谱中都比 WT多出一个差异峰。五个表达菌株的GC-MS图谱中均有峰面积的增高。未来表达菌株中的差异化合物进一步分离鉴定后有助于研究TalA基因的功能。4、菌株AO-TalA-1、AO-TalA-2、AO-TalA-ER-3、AO-TalA-ER-7和AO-TalA-ER-9在生长速率、产三维菌网和捕食线虫能力上均有所下降。五个表达菌株在双氧水氧化胁迫和刚果红细胞壁干扰活性测试中均不及WT。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 论文综述
•   前言
•   1 通过异源宿主表达PKS-NRPS杂合基因簇
•     1.1 PKS-NRPS杂合酶的结构功能
•     1.2 丝状真菌异源表达生物合成基因的研究
•       1.2.1 生物合成途径的构建
•       1.2.2 异源宿主的选择
•   2 通过CRISPR-Cas9编辑SMs调控因子
•     2.1 真菌BGCs的激活机制
•     2.2 丝状真菌CRISPR-Cas9基因组编辑的研究进展
•   本章小结
• 第二章 杜邦嗜热菌2个调控因子的研究
•   引言
•   一 目的基因的预测
•     1 预测和分析的方法
•     2 预测和分析的结果
•       2.1 筛选基因
•       2.2 所选基因的氨基酸序列分析以及系统发育树分析
•     2.2.1 基因TF3的选择原因分析
•     2.2.2 基因McrA的选择原因分析
•   二 敲除载体的构建及敲除
•     1 实验材料和仪器
•       1.1 实验所用培养基,主要试剂及试剂盒,主要仪器设备
•       1.2 供试菌株和所用质粒
•     2 实验方法
•       2.1 Cas9表达质粒的构建
•       2.2 sgRNA表达质粒的构建
•       2.3 杜邦嗜热菌原生质体的转化
•       2.4 Cas9基因编辑结果验证
•       2.5 基因编辑株发酵产物化学分析
•   三 结果
•     3.1 杜邦嗜热菌热稳定GeoCRISPR-Cas9基因编辑实验
•     3.2 LC-MS检测分析
•       3.2.1 杜邦嗜热菌野生菌株和基因编辑菌株GeoCas9-ΔTF3 LC-MS检测分析
•       3.2.2 杜邦嗜热菌野生菌株和基因编辑菌株GeoCas9-ΔmcrA LC-MS检测分析
•   四 小结与讨论
• 第三章 少孢节丛孢CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建
•   引言
•   一 目的基因的筛选
•     1 预测和分析的方法
•     2 预测和分析的结果
•       2.1 筛选基因
•       2.2 基因215g283的选择原因分析
•   二 敲除载体的构建及敲除
•     1 实验材料和仪器
•       1.1 实验所用培养基,主要试剂及试剂盒,主要仪器设备
•       1.2 供试菌株和所用质粒
•     2 实验方法
•       2.1 Cas9表达质粒的构建
•       2.2 少孢节丛孢sgRNA表达质粒的构建
•       2.3 少孢节丛孢原生质体的转化
•       2.4 Cas9基因编辑结果验证
•       2.5 基因编辑株发酵产物化学分析
•   三 结果
•     3.1 少孢节丛孢CRISPR-Cas9基因编辑结果
•     3.2 少孢节丛孢野生菌株和基因编辑菌株Δ215g283-Cas9-1LC-MS检测分析
•   四 小结与讨论
• 第四章 杜邦嗜热菌中2个生物合成基因在少孢节丛孢中异源表达的研究
•   引言
•   一 目的基因的预测
•     1 预测及分析方法
•     2 预测和分析的结果
•       2.1 筛选基因
•       2.2 所选基因的氨基酸序列分析以及系统发育树分析
•     2.2.1 基因TalA的氨基酸序列的分析
•     2.2.2 基因ER的氨基酸序列的分析
•   二 敲除载体的构建及敲除
•     1 实验材料和仪器
•       1.1 实验所用培养基
•       1.2 供试菌株和所用质粒
•       1.3 主要试剂及试剂盒
•       1.4 主要仪器设备
•     2 实验方法
•       2.1 引物设计
•       2.2 敲除载体构建
•     2.2.1 质粒选择
•     2.2.2 片段扩增及纯化
•     2.2.3 目的片段与载体的连接
•     2.2.4 原生质体替换原理
•       2.3 原生质体的制备与转化
•     2.3.1 原生质体制备
•     2.3.2 原生质体转化
•       2.4 转化子PCR验证
•     3 实验结果
•       3.1 载体全长验证及转化子敲除验证
•   三 A.oligospora表达菌株相关表型特征及代谢图谱分析
•     1 实验材料
•       1.1 实验相关菌株及线虫种属
•       1.2 培养基、试剂及材料
•       1.3 仪器与设备
•       1.4 主要试剂和材料
•     2 实验方法
•       2.1 少孢节丛孢表达菌株与野生菌株生长速率的检测
•       2.2 少孢节丛孢表达菌株与野生菌株抗逆性的检测
•       2.3 少孢节丛孢表达菌株和野生菌株捕器与捕食线虫能力的检测
•       2.4 少孢节丛孢表达菌株和野生菌株的代谢产物的检测
•     2.4.1 高效液相色谱（HPLC）检测
•     2.4.2 气相色谱质谱（GC-MS）检测
•     2.4.3 高效液相色谱质谱（HPLC-MS）检测
•     3 实验结果及分析
•       3.1 菌落形态及菌落直径生长比较
•       3.3 少孢节丛孢表达菌株与野生菌株抗逆性的检测
•       3.3 少孢节丛孢表达菌株及野生菌株产捕器和捕食线虫能力的比较
•       3.4 HPLC检测分析
•       3.5 GC-MS检测分析
•   四 小结与讨论
• 全文总结与展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 雷倩

导师: 牛雪梅

关键词: 杜邦嗜热菌,少孢节丛孢,异源表达,次生代谢产物

来源: 云南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 云南大学

分类号: Q933

总页数: 107

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