余忠肖晶晶（湖北省随州心医院药剂科441300）
【中图分类号】R979.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）16-0065-03
【摘要】目的建立以高效液相色谱法测定人血清中甲氨蝶呤浓度的方法。方法采用Shim-packVP-ODS(150mm×4.6mm,5μm)的色谱柱；流动相：乙腈—0.3%磷酸（15:85，V/V，用三乙胺调pH2.5）；紫外检测波长为302nm;柱温：40℃;流速：0.8mL•min-1。结果MTX在0.1～100.0μg•mL-1质量浓度内线性关系良好，Y=0.2+30174X，r=0.9994；MTX低、中、高(0.25μg•mL-1、12.50μg•mL-1、100.00μg•mL-1)3种浓度的平均回收率分别为：104.0%、102.3%、102.5%。日内、日间RSD均<3%，最低血清检测浓度50ng•mL-1。结论高效液相色谱法测定甲氨喋呤的血药浓度灵敏度高，结果准确可靠，操作简便，能满足MTX血清浓度的测定。
【关键词】甲氨蝶呤高效液相色谱血药浓度
DetectionofbloodmethotrexateoncentrationwithHPLC
【Abstract】ObjectiveToimproveaHPLCmethodforthedeterminationofmethotrexate(MTX)inhumanserum.MethodsShim-packVP-ODS(150mm×4.6mm,5μm)wasused,acetonitrile—0.3%ortho-phosphoricacid（15:85，V/V，adjustedtopH2.5withTriethylamine）wasusedasmobilephase.TheUVdetectionwavelengthis302nm.ThetemperatureoftheChromatographiccolumnis40℃.Theflowratewas0.8mL•min-1.ResultsThelinearitywasobtainedfrom0.1to100.0μg•mL-1ofMTXinhumanserum(Y=0.0023+0.079X,r=0.9994).Theaverageofrecoverieswere104.0%、102.3%、102.5%.TheRSDwerelessthan3%.Thelowestdetectingconcentrationwas50ng•mL-1.ConclousionAsimple,sensitiveandselectivemethodforthedeterminationofMTXserumconcentrationinhumanwasestablished.
【Keywords】MethotrexateHPLCSerumdrugconcentration
甲氨蝶呤（methotrexate,MTX）为叶酸类抗肿瘤药，抑制DNA合成所需的二氢叶酸还原酶，选择性的作用于DNA合成期（即S期），及G1/S转换期，抑制肿瘤细胞的增殖，对于分裂增殖比率高的白血病细胞作用强[1]。本品安全范围窄，且人体代谢的个体差异大，抗恶性肿瘤的作用强度与给药后所能达到杀灭肿瘤细胞的血药浓度以及持续在该浓度的时间有关。MTX无统一的常规剂量，临床上采用的剂量常为15～5000mg•m2[2]。且MTX在抑制恶性肿瘤细胞的同时对正常组织细胞也产生毒性作用，对非常增殖细胞特别是肝细胞有直接毒性作用[3]，在合理使用解救剂上监测其血药浓度非常必要。我们采用甲氨蝶呤的标准溶液为外标物，建立一种准确、快速、灵敏的HPLC法测定血清中MTX的浓度。
1材料与方法
1.1试剂与仪器MTX标准品（中国药品生物制品检定所，批号100138-200603）；注射用MTX（0.5g，山西普德药业有限公司，20090201）；磷酸（分析纯，北京市庆盛达化工技术有限公司）；乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；日本岛津LC-20A，HPLCSPD-20A，TU-1901紫外检测器，LC-20AB输液泵，SCL-10Avp系统控制器；80-1高速离心机(上海手术器械厂)；ZH-2自动旋涡混合仪(天津药典标准仪器厂)；PHS-2C型数显酸度计(中国杭州雷磁分析仪器厂)；金利牌超声波清器(JL-60DTH)。
1.2方法
1.2.1色谱条件色谱柱：C18(150mm×4.6mm,5μm)；柱温：40℃；流动相：乙腈：0.3%磷酸（15:85，V/V，用三乙胺调pH2.5）；紫外检测波长302nm；流速0.8ml•min-1；进样量：20μl；灵敏度：1.00AUFS。
1.2.2标准溶液的配制精密称取0.02261gMTX，用配制的流动相配成质量浓度分别为226.1μg•mL-1、9.044μg•ml-1高、低浓度的溶液为外标物。
1.2.3血清样品处理精密吸取患者血清0.4mL加入15ml尖底塑料离心管中，加入10%三氯醋酸溶液0.4ml，漩涡振荡1min，经高速离心(4000rmin-1)min，小心取上层溶液20μl进样。
1.2.4对照血清溶液的制备精密吸取健康空白血清0.4ml，置10ml尖底塑料离心管中，分别加如甲氨蝶呤标准溶液（226.1μg•ml-1、20μl；9.044μg•ml-1、10μl）分别配制成高、低标准，按“1.2.3”项下对样品处理方法处理进样。
2结果
2.1色谱行为由色谱图可知，在与高、低浓度对照品色谱峰保留时间(t=2.376min)相应的位置上，样品溶液具有相同保留时间的色谱峰出现。低浓度样品溶液的色谱中出现比较明显的峰，与样品溶液的色谱相似，用以计算样品中MTX的浓度。高浓度空白血清溶液、低浓度空白血清溶液以及样品血清溶液的色谱图见图1.
2.2标准曲线及检测限取0.8mL的空白血清分别配制MTX质量浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、20.0、40.0、60.0、100.0μg•ml-1的系列样品，按“1.2.3”项下对样品进行处理后进样20μL，以MTX浓度为横坐标，2次测得的MTX峰面积平均值为纵坐标求得直线回归方程：Y=0.2+30174Xr=0.9994，r=0.9994。在0.1～100.0μg•ml-1范围内线性关系良好。以样本信号为噪声3倍作为最小可检测的信号，得最低检测限为50μg•ml-1。
2.3加样回收率试验与精密度试验分取空白血清0.4ml，精密加入MTX标准溶液适量，使其血药浓度为低、中、高3种浓度MTX标准血样各4份，按“1.2.3”项下对样品处理方法处理进样，计算日内RSD,每日测定，连续4d，计算日间RSD,结果见表1。
表1MTX血药浓度的回收率及其精密度
2.4样品稳定性试验按“2.2”项下标准曲线制备方法分别配置低、中、高浓度(0.25μg•mL-1、12.50μg•mL-1、100.00μg•mL-1)的3组18个样品(双样)，分别在室温(25～28℃)放置4h，-20℃冻存24h、1周和3周后分别进行色谱测定，未见封存样品的药物降解。
2.5样品的质量控制按按“2.2”项下标准曲线制备方法分别配置低、中、高浓度(0.25μg•mL-1、12.50μg•mL-1、100.00μg•mL-1)36个血浆样品(一式12份)置-20℃冻存备用，即为质量控制样品。每次检测血样时同时检测质量控制样品，如果相对回收率均在85%～115%内，即可认为仪器检测正常，否则须检查整个操作过程以及仪器原因。
2.6临床应用患者，男，急性淋巴细胞白血病，静脉注射MTX30mg，每周一次。本法测定注射MTX48h后血药浓度为9.68μmol•L-1，结果未超过其中毒浓度(48h后怀疑中毒浓度为10μmol•L-1[4])。
3讨论
MTX的测定方法较多，有些方法无法区分MTX原药及其代谢产物，结果影响MTX的测定。因此，国外多采用具有较高特异性和灵敏度的高效液相色谱法同时测定MTX及其代谢产物7-OHMTX，此方法具有操作简便、出峰较快、所需样品少等特点。简化了繁琐的提取过程，十几分钟分析一个样本，且MTX与其代谢峰完全分离，色谱分离理想，标准曲线线性关系良好，精密、准确、特异性强、回收率高[5]。MTX鞘内注射1次，脑脊液中有效浓度可持续6日左右,鞘内注射后可从脑膜入血。在体内分布以肝、肾为主，骨髓也有一部分,不易透过血脑屏障，静脉注射后脑脊液中浓度不及血中的10%。于治疗浓度时，血浆蛋白结合率为60%～85%。其分布容积占体重的67%～91%。主要由肾脏以原形于尿中排出。肾清除率（CIR）为80～200mL•min-1。48h由尿中排出量为40%～90%，小量排入胆汁中，在肝肾及胸膜腔积液中可潴留数周，排除很慢。肝肾功能不全时排泄减慢、毒性增加[1]。
受目前分析测定技术的限制，很难直接测定药物作用部位的实际浓度，但是，各器官组织的药物浓度都与血浆药物浓度保持这平衡关系；不论是原形药还是代谢药，都要通过血液进行转运，这是其他体液不能相比的；能够采集的其他体液，药物在其中的分布受到一定条件的限制，如选择尿液的条件是药物必须通过或主要通过肾排泄，选择唾液的条件是药物一定要在这种偏碱性的体液中能够分布才行，而只有选择血液才不受药物分布的各种限制[6]。因而，测定MTX的血药浓度对MTX进行个体化治疗具有重要意义。
参考文献
[1]高仲阳，徐彦贵.治疗药物监测技术[M].第1版.北京：化学工业出版社生物•医药出版分社，2007：105.
[2]吴莱文.治疗药物监测[M].第1版.人民卫生出版社，1989：360.
[3]陈新谦.金有豫.新编药物学[M].第13版.北京：人民卫生出版社，1992：437-438.
[4]高仲阳，徐彦贵.治疗药物监测技术[M].第1版.北京：化学工业出版社生物•医药出版分社，2007：5.
[5]高仲阳，徐彦贵.治疗药物监测技术[M].第1版.北京：化学工业出版社生物•医药出版分社，2007：108.
[6]蒋学华.临床药动学[M].第1版.北京：高等教育出版社，2007：17.