Dux基因在小鼠合子基因组激活过程中的作用研究

论文摘要

哺乳动物受精后,合子基因组转录处于沉默状态,胚胎着床前发育主要受控于母源物质。随着卵母细胞中母源物质降解,新形成的胚胎基因组将发生大规模转录,这一事件被称为合子基因组激活（Zygotic genome activation,ZGA）。作为母源-合子转换的关键环节,ZGA是受精后发生的重要生物学事件。对胚胎的正常发育至关重要。深入了解ZGA事件,将有助于克服胚胎体外发育阻滞问题,从而为辅助生殖技术在临床实际应用扫除障碍。为研究Dux基因在小鼠早期胚胎发育,特别是在ZGA过程中的作用。首先利用RT-qPCR和免疫荧光技术检测Dux和Zscan4、MERVL、Eif1a等ZGA相关基因在早期胚胎发育各个时期的表达情况,结果表明Dux的mRNA在早期胚胎发育各时期均可被检测到,但在2-细胞时期表达量最高;与mRNA表达不同的是,Dux编码的蛋白仅能在2-细胞和4-细胞时期被检测到;作为ZGA事件的标志基因Zscan4、MERVL、Gm6763和Eif1a均呈现出在2-细胞特异性高表达,与Dux的表达模式相一致。为进一步研究Dux的作用,我们通过显微注射siRNA直接干扰Dux在受精卵中的表达,分析Dux的敲减对Zscan4、MERVL、Eif1a和Tcstv1等ZGA相关基因和胚胎发育的影响。检测结果表明,Dux的敲减效率约为60%。发育率统计分析表明,干扰组的桑椹胚与囊胚形成率均显著低于对照组（31%vs.83%,P<0.001;28%vs.76%,P<0.001）。此外,干扰组的胚胎发生2-细胞阻滞的现象。为解释这一现象,我们对ZGA相关基因进行定量检测,其中Zscan4的表达与Dux呈现正相关。因此,Zscan4与Dux可能存在直接作用的关系。为了验证这一推测,我们构建了双荧光素酶报告基因系统。双荧光素酶结果表明,DUX结合到Zscan4上游启动子的LTR处（156-163bp）,直接调控Zscan4的表达。鉴于Dux在ZGA过程中所发挥的重要作用,为了能够直接在体内研究Dux的功能,我们构建了Dux过表达小鼠。为今后的研究提供了相关的实验材料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述 母源-合子转换过程中表观遗传的动态变化
•   1 表观遗传变化
•   2 与MZT相关的调控因子
• 第二章 实验研究 Dux基因在小鼠合子基因组激活过程中的作用研究
•   前言
•   1 材料
•     1.1 仪器和设备
•     1.2 耗材和实验动物
•       1.2.1 耗材
•       1.2.2 实验动物
•     1.3 试剂及配制
•       1.3.1 分子实验相关试剂
•       1.3.2 免疫荧光相关试剂
•       1.3.3 试剂配制
•   2 试验方法
•     2.1 实验设计
•       2.1.1 Dux在小鼠植入前胚胎发育中的动态变化
•       2.1.2 Dux对胚胎发育的影响
•       2.1.3 验证Dux与 Zscan4 的作用关系
•       2.1.4 数据统计
•       2.1.5 Dux过表达小鼠的构建
•     2.2 操作方法
•       2.2.1 超数排卵
•       2.2.2 受精卵和MII期卵母细胞的收集
•       2.2.3 胚胎的体外培养
•       2.2.4 实时荧光定量PCR操作
•       2.2.5 胚胎免疫荧光染色
•       2.2.6 胚胎的免疫印迹分析
•       2.2.8 细胞转染
•       2.2.9 双荧光素酶报告基因活性检测
•       2.2.10 Dux过表达小鼠的鉴定
•   3 结果
•     3.1 Dux在植入前胚胎发育中的动态变化
•       3.1.1 Dux在植入前胚胎发育中的表达模式
•       3.1.2 ZGA相关基因在MII卵母细胞和植入前胚胎发育中的表达模式
•     3.2 Dux对胚胎发育的影响
•       3.2.1 Dux敲减效率检测
•       3.2.2 Dux敲减后的胚胎发育情况
•       3.2.3 Dux敲减后ZGA相关基因表达的影响
•     3.3 验证Dux与 Zscan4 的作用关系
•       3.3.1 LTR与 Zscan4 上游理论启动子区域序列比对的结果
•       3.3.2 Dux表达载体构建
•       3.3.3 萤火虫荧光素酶的构建
•       3.3.4 双荧光素酶报告基因系统检测结果
•     3.4 Dux过表达小鼠的鉴定
•   4 讨论
•   5 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨宗轩

导师: 李光鹏

关键词: 合子基因组激活,胚胎发育

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 内蒙古大学

分类号: Q953

总页数: 68

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