导读:本文包含了转基因兔论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:转基因,乳腺,血栓,转染,瘟病,生活史,合子。
转基因兔论文文献综述
姜磊[1]（2018）在《乳腺特异性表达rhPA转基因兔的繁育及表达产物的纯化与分析》一文中研究指出天然人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)存在半衰期短,容易失活,内出血风险等问题,而我们进行相应改造的重组人组织纤溶酶原激活剂(rhPA)则具有半衰期延长、产量提高、与人体相容性高等优点。本实验室构建的重组PCL25/rhPA表达载体内含有CMV增强子调控元件以及获得的转基因纯合子兔整合拷贝数2倍于半合子,导致了其高效表达的能力,表达产量及活性的提高,有助于表达水平较高的转基因兔进行纯合子培育及传代扩系。现阶段目前临床上应用的t-PA及其突变体大多是在原核大肠杆菌中表达,少部分由动物或昆虫细胞表达,从乳汁中分离纯化rhPA尚未见报道。我利用多种纯化手段,研究从转基因兔乳中将rhPA分离出来的方法,从而确保从转基因兔乳中纯化的rhPA的纯度、生物活性及稳定性。乳腺特异性表达rhPA转基因兔的筛选与繁育将山羊BLG信号肽编码区和人t-PA的K2和P结构域的编码序列克隆到含有山羊β-酪蛋白基因的5'基因组片段和CMV启动子/增强子的PCL25载体中作为嵌合启动子/增强子,构建了 PCL25/rhPA乳腺特异性表达载体。经原核显微注射PCL25/rhPA表达载体线性片段后,共获得存活仔兔48只,经PCR检测整合阳性兔27只。对FO代转基因兔乳清进行ELISA检测并测定OD450值,结果获得11只能在乳腺中表达rhPA的PCL25/rhPA表达载体转基因兔。通过对F2代转基因兔测交后代的检测,筛选出4只转rhPA基因纯合子兔(编号C1-C4)。将纯合子兔与半合子兔乳清样品进行ELISA检测并测定OD450值,发现转基因纯合子兔乳清中rhPA的表达量明显高于半合子转基因兔乳清中的表达量。通过FAPA法将获得的转基因兔乳清稀释后与注射用阿替普酶药物比较,结果显示表达rhPA的转基因纯合子兔与半合子兔乳清均在纤维蛋白平板上产生了明显的溶栓透明圈,均具有溶栓活性功能,但纯合子转基因兔溶栓活性强于半合子转基因兔。对转基因兔乳清进行SDS-PAGE电泳和WestemBlot检测分析,检测发现rhPA转基因兔乳清中含41KDa左右条带,与目标蛋白rhPA的大小相符。表达产物rhPA的纯化与分析经20000 g离心、35%饱和硫酸铵沉淀、酸碱沉淀及超滤等乳样前处理后,除去了如酪蛋白、脂肪等不溶性物质及大部分的盐离子和小分子物质,再利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等方法进一步分离纯化rhPA。发现采用0.5 mol/L L-Arg +0.5 mol/L Nacl 的 25 mmol/L PB 缓冲液(pH5.5)洗脱液进行 Lysine HyperD亲和层析时能将大部分目标蛋白洗脱下来;BlueSepharose6FF亲合层析时,通过阶段梯度洗脱后发现采用0.4mol/LNaCl的25 mmol/L PB缓冲液(pH8.0)淋洗再用1 mol/LNaCl的25 mmol/LPB缓冲液(pH8.0)洗脱时能将杂蛋白去除的同时洗脱下目标蛋白。SP BestaroseTM FF离子交换时,通过线性梯度洗脱后发现采用0.3 mol/L NaCl的 20 mmol/LPB 缓冲液(pH5.0)淋洗再用 1 mol/LNaCl 的 20 mmol/LPB 缓冲液(pH5.0)能分离出目标蛋白。最后应用Surpdex G75凝胶过滤预装柱进一步精细分离纯化目标rhPA。各层析方法洗脱产物经FAPA法检测均具有生物活性且未失活;同时各层析方法洗脱产物经平衡液置换后进行SDS-PAGE检测均出现约41 KDa大小的rhPA目标蛋白条带。转基因兔乳汁经多种纯化方法提纯后的纯化产物,经ELISA半定量与原乳清比较计算回收率为30%。运用Quantity One 1-D分析软件进行SDS-PAGE纯度分析,纯化后纯度达96%以上。Western Blot检测纯化产物中含有41 KDa左右条带,与目标蛋白rhPA的大小相符。获得的最终纯化产物通过FAPA法比较其与注射用阿替普酶药物在体外的溶栓生物活性的比活性,结果发现纯化产物在保持高效的体外溶栓生物活性功能的同时比活性是注射用阿替普酶药物的150倍左右。通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱进行相对分子质量分析测定,结果显示该纯化产物与提供的理论序列比对结果相符,分子量大小为41713 Da。rhPA的N-和C-末端蛋白质序列测定表明纯化的蛋白质是完整的,进一步确定该纯化产物为重组人纤溶酶原激活剂。本研究筛选出了能在乳腺中高表达rhPA的PCL25/rhPA表达载体转基因兔,并以此为基础培育的该品系转基因纯合子兔rhPA的表达量及体外溶栓活性均高于半合子转基因兔。本试验通过多种纯化技术相结合的方法,最终获得在保持高效的体外溶栓生物活性功能的同时比活性是注射用阿替普酶药物的150倍左右的纯化产物rhPA,为之后的纯化研究提供了新的思路。(本文来源于《扬州大学》期刊2018-06-10）
范江霖[2]（2017）在《利用转基因兔研究MMPs在动脉硬化症中的新功能（英文）》一文中研究指出Matrix metalloproteinases(MMPs)play an important role in the pathogenesis of vascular diseases,such as atherosclerosis,plaque rupture and aneurysms.It has been known for many years that in the arterial wall,many MMPs are produced by a variety of arterial cells;however,their functional roles in atherosclerosis are still not fully understood.During the past years,our laboratory has been focusing on the elucidation of macrophage-derived(本文来源于《中国生理学会基质生物学专业委员会第二次全国基质生物学学术会议会议手册》期刊2017-06-07）
陶鸽如[3]（2017）在《表达兔瘟病毒VP60-P2的转基因兔球虫激发特异性免疫应答的研究》一文中研究指出养兔业的健康发展受到兔瘟和兔球虫病的严重威胁。兔瘟组织灭活疫苗潜在的生物安全隐患、仔兔的疫苗免疫持续期短,以及慢性感染家兔的持续排毒是兔瘟防控需解决的重要问题。同时,兔球虫具有良好的免疫原性,一次免疫即可激发较强的黏膜免疫应答。近年来本课题组一直进行以转基因艾美耳球虫为载体的活疫苗研究,以期为生产提供更加安全、便捷的免疫策略。因此,本研究以兔球虫为载体重组表达兔瘟病毒衣壳蛋白VP60-P2亚域,评估转基因兔球虫作为重组疫苗载体的可行性,为兔瘟和兔球虫病新型疫苗的研发提供思路。我们首先利用染色体步移的方法获取了大型艾美耳球虫proflin基因的调控序列,并通过体外转染证实了其启动外源基因在兔球虫表达的能力。但我们未能使用该调控序列实现兔球虫的稳定转染,故此我们使用柔嫩艾美耳球虫保守的组蛋白4(His4)基因作为调控序列进行转染,成功获得了一株表达黄色、红色荧光蛋白的转基因大型艾美耳球虫(EmagER)。我们观察到荧光蛋白在球虫生活史的各个阶段均有表达;生物学特性对比试验结果表明,EmagER与原始虫株具有相似的繁殖力和免疫原性。为检测转基因球虫激发宿主免疫应答的能力,我们针对当前家兔免疫学和疫苗学研究工具比较缺乏的现状,建立了家兔细胞免疫检测平台。我们利用qPCR方法对EmagER接种后家兔免疫应答相关的细胞因子转录水平进行了检测。结果显示EmaER免疫能够有效激发家兔肠道部位(肠系膜淋巴结,mesenteric lymphnodes,MLN)的淋巴细胞产生针对外源蛋白的Th-1型细胞免疫应答。此外,我们还制备了针对家兔CD3、CD4、CD8、IFN-γ、TNF-α等免疫分子的单克隆抗体,通过免疫印迹和流式细胞术验证,获得了可用于流式细胞术的CD4和TNF-α单克隆抗体。为家兔免疫学研究提供了有力的工具。进而,我们构建了表达兔瘟病毒衣壳蛋白VP60-P2亚域的转基因大型艾美耳球虫(EmagE-VP60)。我们发现,在虫体的裂殖生殖时期,VP60-P2在细胞膜表面和胞浆内同时表达,能够被宿主免疫系统识别。EmagE-VP60免疫家兔后,针对VP60-P2蛋白的抗体水平和外周血单个核细胞特异性CD8+TNF-α+细胞比例较野生.虫株免疫组稍有上升但无显着差异;肠道派尔氏结(payer's patches)、MLN淋巴细胞经VP60-P2刺激后,Th-1型细胞因子相对转录水平较野生虫株免疫组显着上升。这些结果表明,EmagE-VP60表达的VP60-P2能够在肠道部位激发宿主产生针对外源蛋白的特异性免疫应答。综上所述,本研究首次建立了兔艾美耳球虫的转染平台,构建了表达兔瘟病毒抗原的转基因大型艾美耳球虫。转基因球虫免疫后能够激发宿主在肠道部位产生针对外源蛋白的特异性免疫应答,为今后的转基因兔球虫活载体疫苗的免疫机制研究和应用研发提供了良好的基础。(本文来源于《中国农业大学》期刊2017-05-01）
成勇,陆睿,宋绍征,陈思,姜磊[4]（2016）在《转基因兔乳腺特异性表达重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)及其药效学研究》一文中研究指出自上世纪以来,血栓性疾病一直是危害人类健康和生命安全的头号因素,溶栓疗法是目前临床上使用最广泛而有效的一种治疗方法,而且溶栓药物已经历了叁代发展。重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)是一种丝氨酸蛋白酶,能够高效特异地溶解血栓,属的第叁代溶栓药物。本研究构建了rhPA乳腺特异性表达载体,应用到转基因兔制备一种新颖、高效的溶栓药物。相关研究方法和结果如下:在获得rhPA表达兔(1mg/mL)以上的基础上,应用3株自制的高效价小鼠单克隆抗体制备亲和层析柱。通过离心脱脂、饱和硫酸铵沉淀、超滤及透析等兔乳前处理,获得粗纯品。将C4株抗体与CNBr activated Bestarose 4FF偶联来制备免疫亲和层析柱。0.75mol/L硫酸铵斗40%丙二醇的TE缓冲液(pH7.9)洗脱获得半纯品。Sephedex75凝胶过滤纯化目标蛋白,获得纯度96%-99%rhPA。与阿替普酶对照品相比,圆二色谱分析显示,该纯化产物与阿替普酶有相似的二级结构;FAPA测定纯化产物rhPA的体外溶栓比活性,其值高达约214倍,远远高于阿替普酶溶栓药。纯品经去内毒素处理后,分别以0.3mL/只小鼠腹腔注射角叉菜胶诱导的尾部血栓小鼠,结果显示以不同的"给药"浓度0.1mg/只剂量组、0.4mg/只剂量组、1.6mg/只剂量组及阿替普酶、生理盐水对照组对小鼠进行溶栓试验,结果显示rhPA各剂量组能有效消除小鼠尾部血栓。结果表明,转基因兔表达产物rhPA能够能够从兔奶中分离纯化出来;纯化产物具有高回收率、高纯度、高生物活性,体内外溶栓试验显示rhPA具有较阿替普酶更好的疗效。同时表明已经建立一套比较完备的转基因动物制药下游技术体,这在国内外尚未见报道,为以后大量生产新型溶栓药物提供了新的思路,也为后期进一步临床试验奠定了基础。(本文来源于《中国畜牧兽医学会兽医产科学分会第十叁次学术研讨会论文集》期刊2016-10-22）
宋绍征[5]（2016）在《转基因兔乳腺特异性表达重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）及其药效学研究》一文中研究指出自上世纪以来,血栓性疾病一直是危害人类健康和生命安全的头号因素,溶栓疗法是目前临床上使用最广泛而有效的一种治疗方法,而且溶栓药物已经历了叁代发展。人组织纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator, t-PA)是由血管内皮细胞合成并分泌的一种丝氨酸蛋白酶,能够高效特异地溶解血栓,是一种良好的第二代溶栓药物。重组人纤溶酶原激活剂(recombinant human plasminogen activator, rhPA)是天然t-PA的重组突变体,属于新型第叁代溶栓药物,具有较天然t-PA更加优越的溶栓功能。利用动物乳腺生物反应器来生产t-PA及其重组突变体,具有产量高、成本低、翻译后修饰、生物活性高等优于其它表达系统的特点。应用多种纯化技术相结合的策略,能够方便、快捷、高效地将目标蛋白从动物乳汁中分离纯化出来。现今,国内外已有很多关于以上研究内容的报道。本研究目的旨在：将构建正确而有效的rhPA乳腺特异性表达载体(F、E、K1区缺失重组体t-PA)应用到转基因兔中,研究其表达水平和活性功能,以期获得高效表达rhPA的转基因兔；研究各种分离纯化表达兔乳中rhPA的方法和策略,以期获得高纯度、高回收率、高活性的rhPA;研究小鼠血栓和溶栓模型,以期获得最佳的动物溶栓效果；同时,还研究了rhPA单克隆抗体的制备和筛选方法,以期获得能够用作亲和层析配体的多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)。从而,最终获得一种新颖、高效的溶栓药物。相关研究方法和结果如下：1.采用常规分子生物学技术,分别以山羊p-酪蛋白基因(β-casein)、山羊p-乳球蛋白基因(BLG)和牛αs1酪蛋白基因(asl-casein)作为调控元件,以天然t-PA的F、E、K1区缺失体作为编码蛋白序列,构建了乳腺特异性表达载体PCL25/rhPA、BLC14/rhPA和AP/rhPA。经酶切图谱和测序比对结果显示,构建的载体与理论序列完全一致。2.通过胶原酶消化组织法建立山羊乳腺上皮细胞分离培养体系,电转染叁种载体,经600μg/mL G418筛选两周后,挑取生长旺盛、状态较好的单克隆细胞集落,传代扩大培养。经PCR检测,PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA叁种载体分别获得了79株、66株、63株整合阳性单克隆细胞株,并应用51μM催乳素进行诱导表达。ELISA检测72h后细胞诱导上清液,25株转PCL25/rhPA基因细胞株高水平表达rhPA,3株转BLC14/rhPA基因细胞株表达rhPA,而转AP/rhPA基因细胞株未见表达。经纤维蛋白平板溶圈法(FAPA)检测,所有诱导表达上清液均具有体外溶栓活性功能。结果表明,在细胞水平,PCL25/rhPA和BLC14/rhPA载体能够有效地驱动rhPA基因特异性表达,且PCL25/rhPA载体的表达水平明显高于其它两种载体。从而,验证了构建的PCL25/rhPA载体是合理而有效的。3.将以上叁个构建(PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA)经显微注射导入到兔受精卵中,共移植94只受体,妊娠71只,出生319只仔兔,PCR检测85只为转基因整合阳性兔,妊娠率为75.5%(71/94),整合率为26.6%(85/319)。ELISA检测57只存活转基因兔(或后代)乳汁,共12只乳腺特异性表达rhPA (PCL25/rhPA11只,BLC14/rhPA1只),表达水平约在5.2-630 μg/mL之间。SDS-PAGE电泳和Western Blot检测该12只兔乳,均出现约39KDa大小的目标特异性条带。FAPA结合ELISA测定表达产物的体外溶栓比活性,最高可达360倍左右(A29,与阿替普酶相比)。测交检测高表达水平的A29系转基因兔,1只F2代(A29F2-09)的所有后代仔兔均为整合阳性(100%,13/13)；Real-time PCR检测相对拷贝数,该只兔约是其它同系转基因兔的2倍。从而,证明了A29F2-09为纯合子转基因兔,且rhPA表达水平约1000μg/mL,明显高于非纯合子兔；不同系转基因兔拷贝数与表达水平间没有相关性。以上结果表明,PCL25/rhPA载体能够在转基因兔乳腺中高效表达活性rhPA;表达水平主要与整合位点有关；当整合位点一致时,表达水平随拷贝数的增加也相应地累积提高。4.通过传统弗氏佐剂和快速免疫佐剂两种方法免疫小鼠,结果显示在免疫小鼠血清效价、免疫原剂量和免疫周期上,快速免疫佐剂都大大地优越于弗氏佐剂(1010/109,20μg/1300μg,35d/70d)。通过电脉冲和化学PEG两种方法将免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,结果显示电融合效率明显高于化学PEG融合(166%/88.4%)。通过HAT和HT筛选及有限稀释法亚克隆后,共获得12株能够稳定分泌高效价抗体的杂交瘤细胞株(标号Cl-C12)。ELISA-elution检测,有3株为多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb,标号C1、C4、C8),占单克隆抗体总数的25%(3/12)。小鼠腹腔诱导法大量制备抗体,C1、C4、C8株腹水效价分别是108、1010、108,且无交叉非特异性反应,能够为亲和层析所用。5.通过离心脱脂、35%饱和硫酸铵沉淀、超滤及透析等方法进行兔乳前处理,获得粗纯样品。将C4株抗体与CNBr activated Bestarose 4FF偶联来制备免疫亲和层析柱,偶联率高达96.5%。尝试五种不同的洗脱液(A:0.1mol/L甘氨酸,pH2.5;B:0.1mol/L甘氨酸,pH3.5；C:0.1mol/L甘氨酸,pH5.0; D:0.75mol/L硫酸铵+40%丙二醇的TE缓冲液,pH7.9; E:0.2M NaH2PO4-柠檬酸,pH2.2),来探索最佳洗脱效果的条件,结果显示0.75mol/L硫酸铵+40%丙二醇的TE缓冲液(pH7.9)洗脱效果最佳,但pH较低的强酸缓冲液(A、B、E)也能够达到洗脱要求,而pH较高的C洗脱液则出现杂蛋白较多且回收率低。再尝试Chromdex75 prep grade凝胶过滤预装柱来进一步分离纯化目标蛋白rhPA,上样体积为1%和2.5%能够将目标蛋白完全分开,出现两个独立的峰；而上样体积为5%则不能够将目标蛋白完全分开,出现两个相互交叉重迭峰。经免疫检测及飞行时间质谱鉴定该纯化产物为目标rhPA。与BSA对照品相比,双向电泳结果显示,纯化产物的大小约39KDa(在35-40KDa之间),等电点约7.1(BSA等电点约4.7),纯度可达96%-99%或更高(BSA纯度96%-99%)。与阿替普酶对照品相比,圆二色谱分析显示,该纯化产物与阿替普酶有相似的二级结构；FAPA测定纯化产物rhPA的体外溶栓比活性,其值高达约214倍,远远高于阿替普酶溶栓药。6.以HitrapTM CaptoTM Q-1mL离子交换柱去内毒素,经试剂盒测试,内毒素含量低于0.015EU/mL.分别以0.3mL/只小鼠腹腔注射1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%浓度的角叉菜胶,来探索诱导小鼠尾部血栓形成的最佳条件,结果显示以0.05%浓度的角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓形成条件最佳。以不同的“给药”浓度(低剂量组0.1mg/只、中剂量组0.4mg/只、高剂量组1.6mg/只及阿替普酶、生理盐水对照组)对小鼠血栓模型病进行治疗,结果显示纯化产物rhPA作为溶栓药物治疗小鼠尾部血栓,在效果和剂量上明显优越于阿替普酶,且rhPA高剂量组(1.6mg/只)在叁次给药后(32h)能够完全治愈小鼠尾部血栓疾病。以上结果表明,我们构建的F、E、K1区缺失重组体t-PA (PCL25/rhPA载体)是合理、有效的,且能够在转基因兔乳腺中高效表达；表达产物rhPA能够相对单独地存在于兔乳中,且能够被分离纯化出来；纯化产物具有高回收率、高纯度、高生物活性功能,且能够用于动物溶栓模型试验,具有较阿替普酶对照品更好的疗效。同时,也证明了我们所建立的这一整套技术体系是相对完善、可行的,在国内外较少见报道,为以后大量新型重组溶栓药物的研发提供了新的思路,也为后期进一步临床试验奠定了扎实的基础。(本文来源于《扬州大学》期刊2016-06-01）
陆睿,宋绍征,祁正强,葛欣,邵宾[6]（2015）在《重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测》一文中研究指出人组织纤溶酶原激活剂(ht-PA)是临床血栓疾病治疗的主要生物药品,应用转基因动物乳腺生物反应器制备已有报道,但重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)在转基因动物中表达尚未见报道。设计了以人t-PA的F、E、K1区位点缺失体为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子,构建了乳腺特异性表达载体PCL25/rh PA,通过受精卵原核显微注射法制备转基因兔。用PCR检测及其产物测序筛选转基因兔,ELISA试剂盒及纤维蛋白平板溶圈法检测转基因兔的表达产物。实验获得原代转基因兔5只(2♂,3♀),其中2只乳腺中表达人重组纤溶酶原激活剂,rh PA浓度最高可达400μg/m L,表达产物比活性是现有阿替普酶的150-200倍。实验结果表明,重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)可以在山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子调控下获得乳腺特异性表达,表达重组蛋白具有较高的溶栓活性。(本文来源于《生物技术通报》期刊2015年10期）
石团员,魏巍,付媛,鲍国连,郝力力[7]（2015）在《黄荧光蛋白(YFP)转基因兔肠艾美耳球虫获取、生活史、繁殖力和免疫原性观察》一文中研究指出兔球虫是危害家兔健康养殖的重要病原之一,转基因技术是深入研究球虫细胞生物学、球虫与宿主相关作用及其开发用做真核表达载体的重要工具。本研究以兔肠艾美耳球虫(Eimeria intestinalis)弱毒株为模式兔球虫,通过子孢子电转染、无球虫兔体内传代和流式分选等系列试验方法和技术,首先建立了兔球虫稳定电转染体系,并获得了稳定表达YFP的转基因E.intestinalis虫株,转基因球虫卵囊在第叁次传代后的发光比率在80%以上,YFP主要表达在球虫细胞核部位;在获得YFP转基因E.intestinalis虫株的基础上,通过无球虫兔感染、荧光显微观察和克粪便球虫卵囊(OPG)计数等系列试验方法和技术,对YFP转基因兔球虫的生活史、繁殖力和免疫原性进行研究。接种后第4—216 h的观察结果显示,E.intestinalis内生发育整个过程主要在空肠中后段和回肠完成,十二指肠和蚓突有少量后期发育阶段虫体(包括配子体、合子和卵囊)寄生;生活史包括4个裂殖生殖阶段和1个有性生殖阶段,每个裂殖生殖阶段的裂殖子有单核和多核之分、裂殖体也有大、小不同的两个类型;在动物试验中,同样数量的孢子化卵囊(5×10~3个)接种无球虫兔后,YFP转基因E.intestinalis接种兔的平均排卵囊量为2.569×10~8±3.328×10~7/只,繁殖力显着低于野生虫株(p<0.05),野生虫株接种组兔的平均排卵囊量为1.922×10~9±2.069×10~8,但YFP转基因E.intestinalis仍具有较强免疫保护力,攻毒保护率为100%,卵囊减排率为62.25%±3.96%,在攻毒保护率、体重和临床症状等方面与野生虫株免疫组无显着差异。综上所述,本研究建立了兔球虫稳定电转染方法,获得了YFP转基因E.intestinalis虫株,并对其生活史、繁殖力和免疫原性进行了系统研究。结果表明,兔肠艾美耳球虫适合用做外源基因真核表达载体。(本文来源于《中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十叁次学术研讨会论文集》期刊2015-07-25）
祁正强[8]（2015）在《重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）转基因兔纯合子的筛选及表达特性》一文中研究指出血栓性疾病是一类严重危害人类健康和生命的疾病,可累及全身各个器官及系统,目前利用溶栓药物成为治疗此类疾病的主要方法。溶栓药物经过不断研究已发展到第叁代,其中以重组人纤溶酶原激活剂(r-tPA)作为治疗人类血栓性疾病的新型药物。重组人组织纤溶酶原激活剂与天然t-PA具有相似的生物学活性,更具有溶栓能力强、与纤维蛋白亲和力高、全身出血副作用小、半衰期长、总使用剂量少等特点。作为第叁代溶栓药物的新型代表,重组人纤溶酶原激活剂越来越受到血栓病患者的青睐,具有广阔的应用前景。外源基因在转基因纯合子动物的整合拷贝数是转基因半合子动物的两倍。本研究旨在筛选出转rhPA基因纯合子兔,比较外源基因rhPA在转基因纯合子兔和转基因半合子兔乳腺中的表达水平,探索在整合位点相同时,rhPA在转基因兔乳腺中的表达量与其拷贝数之间的关系。筛选高水平表达的转基因纯合子兔,培育用于生物制药的rhPA的转基因纯合子兔品系,为以后大规模制备溶血栓生物药品建立基础,并且用于药理学和生物学活性分析,有利于后期药品开发应用。本研究应用已经构建的乳腺特异表达载体PCL25/rhPA,通过原核期受精卵显微注射制备转rhPA基因家兔。经过PCR整合检测和ELISA表达检测筛选出原代转基因表达兔。F1代转基因表达兔兄妹同胞交配或回交获得F2代转基因兔,通过对F2代转基因兔测交筛选出其中的转基因纯合子兔。ELISA检测比较转基因纯合子兔与半合子兔乳清中rhPA的表达水平。实验以成年新西兰母兔为实验动物,将rhPA基因片段通过显微注射导入受精卵,移植受体64只,其中46只怀孕,出生仔兔207只,PCR整合阳性兔56只,存活37只。妊娠率为71.9%,阳性整合率为27.1%。ELISA检测37只转基因兔(或后代)乳汁,其中12只兔乳腺特异性表达rhPA。获得的rhPA基因表达公兔K29与正常新西兰母兔交配,共获得了F1代仔兔25只,经PCR检测筛选出F1代转基因兔16只,其中母兔10只,公兔6只。从F1代转基因兔中挑选公兔和母兔同胞交配,共获得F2代仔兔10只,经PCR检测筛选出F2代转基因兔5只,其中母兔4只,公兔1只。将F2代转基因兔再与正常兔测交配种,通过对后代的PCR检测,筛选出F2代中转基因纯合子兔。我们从F2代转基因兔中筛选出2只雌性转rhPA基因纯合子兔(编号K29 F2-05和K29 F2-09)。通过对K29 F2-09奶样的ELISA检测,发现其乳汁中重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)的表达水平明显高于半合子转基因兔。本研究获得了乳腺特异性表达转基因兔,建立了PCL25/rhPA转基因兔基本繁殖群(K29系),并培育筛选出2只转rhPA基因纯合了母兔(编号K29 F2-05和K29 F2-09),经ELISA检测结果显示K29 F2-09母兔奶样中的rhPA表达量明显高于转rhPA基因半合子兔。实验研究结果证明PCL25/rhPA在转基因纯合子兔乳腺中的表达量高于转基因半合子兔的表达量。本研究验证了以培育转基因纯合子动物来提高外源基因表达量的可行性,为建立PCL25/rhPA转基因纯合子兔新品系做好铺垫,更为大量研制新型溶栓制剂奠定了基础。(本文来源于《扬州大学》期刊2015-06-17）
董真,金铎,林家琪,展天松,顾敏[9]（2014）在《一株转基因兔源大肠杆菌的分离鉴定与防治》一文中研究指出从扬州大学转基因实验兔中分离到一株革兰氏阴性杆菌,经鉴别培养和生化特性鉴定,确定为大肠杆菌,并进行了药敏试验。药敏试验结果表明,该菌株对氯霉素和卡那霉素等抗生素高度敏感,对复方新诺明和诺氟沙星等抗生素不敏感。(本文来源于《湖北畜牧兽医》期刊2014年05期）
祝洪磊,石元,曾勇庆,陈伟,徐正刚[10]（2014）在《睾丸注射法制备携带猪PID1基因的转基因兔》一文中研究指出目的研究磷酸酪氨酸互作结构域1(PID1)基因与肌内脂肪含量的关系,探究睾丸注射法在转基因动物制备中的可行性。方法将携带猪PID1基因的重组质粒pIRES2-acGFP-PID1与转染试剂共孵育后,对新西兰兔进行了睾丸打点注射试验。对繁殖的F1代个体进行了活体荧光检测、PCR和western blotting检测,以及抽样屠宰进行肌内脂肪含量等检测;将F1代阳性个体互交,繁殖了F2代兔,对其进行了阳性率检测以及肌内脂肪含量检测。结果外源PID1基因和荧光蛋白基因在后代中均成功表达,其中,F1代阳性率为35.88%,F2代阳性率为34.33%;转基因阳性兔与阴性和空白对照兔相比,PID1蛋白表达水平有所增加,肌内脂肪含量有显着提高(P<0.05)。结论 PID1基因与肌内脂肪沉积密切相关,同时,进一步证明了睾丸注射法可以用于制备转基因动物,且外源基因可以稳定遗传。(本文来源于《中国实验动物学报》期刊2014年02期）
转基因兔论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
Matrix metalloproteinases(MMPs)play an important role in the pathogenesis of vascular diseases,such as atherosclerosis,plaque rupture and aneurysms.It has been known for many years that in the arterial wall,many MMPs are produced by a variety of arterial cells;however,their functional roles in atherosclerosis are still not fully understood.During the past years,our laboratory has been focusing on the elucidation of macrophage-derived
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
转基因兔论文参考文献
[1].姜磊.乳腺特异性表达rhPA转基因兔的繁育及表达产物的纯化与分析[D].扬州大学.2018
[2].范江霖.利用转基因兔研究MMPs在动脉硬化症中的新功能（英文）[C].中国生理学会基质生物学专业委员会第二次全国基质生物学学术会议会议手册.2017
[3].陶鸽如.表达兔瘟病毒VP60-P2的转基因兔球虫激发特异性免疫应答的研究[D].中国农业大学.2017
[4].成勇,陆睿,宋绍征,陈思,姜磊.转基因兔乳腺特异性表达重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)及其药效学研究[C].中国畜牧兽医学会兽医产科学分会第十叁次学术研讨会论文集.2016
[5].宋绍征.转基因兔乳腺特异性表达重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）及其药效学研究[D].扬州大学.2016
[6].陆睿,宋绍征,祁正强,葛欣,邵宾.重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测[J].生物技术通报.2015
[7].石团员,魏巍,付媛,鲍国连,郝力力.黄荧光蛋白(YFP)转基因兔肠艾美耳球虫获取、生活史、繁殖力和免疫原性观察[C].中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十叁次学术研讨会论文集.2015
[8].祁正强.重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）转基因兔纯合子的筛选及表达特性[D].扬州大学.2015
[9].董真,金铎,林家琪,展天松,顾敏.一株转基因兔源大肠杆菌的分离鉴定与防治[J].湖北畜牧兽医.2014
[10].祝洪磊,石元,曾勇庆,陈伟,徐正刚.睾丸注射法制备携带猪PID1基因的转基因兔[J].中国实验动物学报.2014
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