鸡干扰素调节因子7的体外表达及其单克隆抗体的研制

论文摘要

IRF7（Interferon regulate factor 7）是激活I型IFN基因转录和表达过程中起着关键性调节作用的IRFs家族成员,它参与机体的天然免疫和获得性免疫调控。在病原体入侵宿主时,宿主模式识别受体与病原相关分子模式相互作用,激活宿主不同的信号通路,磷酸化激活IRF7,使其从细胞浆转移至细胞核内并结合IFN的启动子,激活且释放IFN分子,随后JAK/STAT信号通路被激活,产生许多具有发挥抗病毒功能的ISGs,从而抵御病原体入侵。有研究发现,在哺乳动物中病毒可以通过阻碍IRF7生物学功能影响宿主抗病毒能力,从而完成自身在宿主中的复制,但是在禽类上有关于IRF7的生物学功能以及病毒是如何作用IRF7以逃避机体免疫反应的研究报道却很少,有关IRF7的很多问题亟待解决。本研究旨在通过构建chIRF7的原核和真核表达质粒,研制抗chIRF7单克隆抗体,为今后chIRF7在IFN信号通路中的作用、禽类疾病的基础性研究提供生物材料。主要研究内容和研究结果包括以下两部分:1.鸡干扰素调节因子7基因的克隆与表达为了获得鸡干扰素调节因子7（IRF7）的原核及真核表达质粒,本研究通过分离鸡外周血淋巴细胞,抽提RNA并将其反转录,获得鸡淋巴细胞cDNA,将其作为chIRF7基因扩增模板。根据GenBank上已发布的chIRF7基因序列设计合成两对特异性引物,应用聚合酶链式反应扩增获得chIRF7目的基因,将其分别克隆至原核表达载体pCOLD-TF和真核表达载体 pcDNA3.1-rIgG 中,构建成 pCOLD-TF-chIRF7、pcDNA3.1-chIRF7-rlgG 重组质粒。将测序正确的pCOLD-TF-chIRF7质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）感受态中,通过0.25mmol/L异丙基-β-D硫代半乳糖苷低温诱导20h,经SDS-PAGE和Western-blot验证,结果显示融合蛋白HIS-chIFR7能够获得表达,且分子量大小为107kDa左右,与预期目的蛋白大小一致。将测序正确的真核质粒经TransIT-LT转染入DF-1细胞,应用间接免疫荧光和Western-blot方法进行验证,结果显示重组的chIRF7蛋白在DF-1细胞中能够获得表达。chIRF7原核及真核重组质粒的获得为进一步研制抗chIRF7单克隆抗体提供了材料。2.抗鸡干扰素调节因子7单克隆抗体的研制为制备针对抗鸡干扰素调节因子7单克隆抗体,本研究用含原核表达蛋白产物HIS-chIRF7为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,每间隔10天免疫一次,第4次免疫结束后进行细胞融合。通过利用pcDNA3.1-chIRF7-rIgG真核质粒转染入DF-1细胞,并应用间接免疫荧光和Westerm blot方法对杂交瘤细胞上清进行筛选,结果获得4株能够稳定分泌抗chIRF7单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将其分别命名为chIRF7-lF12、chIRF7-2B7、chIRF7-5A2、chIRF7-6G7。经过两次亚克隆,杂交瘤细胞达到100%分泌抗chIRF7特异性抗体。亚类鉴定结果表明chIRF7-lF12亚型为IgG2b,其余均为IgGl。通过构建5个chIRF7分段基因的真核质粒,分别转染入DF-1细胞并应用间接免疫荧光方法对4株单抗的抗原表位进行分析,结果表明 chIRF7-lF12、chIRF7-2B7、chIRF7-5A2、chIRF7-6G7 抗原表位分别位于chIRF7全长蛋白的36-115aa,184-247aa,36-115aa,142-182aa。应用间接免疫荧光方法对4株单抗腹水进行效价测定,结果表明4株单抗IFA效价均在1:128000以上。本研究成功制备了抗chIRF7单克隆抗体,为进一步研究chIRF7的表达调控机制及其在IFN信号通路中的作用奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 文献综述
•   1 干扰素概述
•   2 干扰素调节因子家族
•   3 干扰素与IRF7之间的关系
•   4 干扰素调节因子7的结构
•   5 干扰素调节因子7功能
•   6 干扰素调节因子7的活性调控
•   7 单克隆抗体技术
•   8 本研究的目的和意义
• 研究内容一 鸡干扰素调节因子7基因的克隆与表达
•   1 材料
•     1.1 细胞及实验动物
•     1.2 载体、主要试剂
•     1.3 主要仪器和设备
•     1.4 主要试剂的配制
•   2 方法
•     2.1 鸡淋巴细胞cDNA的获得
•     2.2 鸡IRF7基因的引物设计与PCR扩增
•     2.3 重组质粒pCOLD-TF-chIRF7的构建及鉴定
•     2.4 chIRF7原核重组蛋白的诱导表达及鉴定
•     2.5 chIRF7真核质粒的构建及鉴定
•   3 结果
•     3.1 鸡IRF7的PCR扩增结果
•     3.2 chIRF7原核表达质粒的构建
•     3.3 chIRF7融合蛋白的诱导表达
•     3.4 chIRF7原核重组蛋白的Western blot鉴定
•     3.5 chIRF7真核表达质粒的构建
•     3.6 chIRF7真核重组蛋白表达的间接免疫荧光鉴定
•     3.7 chIRF7真核重组蛋白表达的Western blot鉴定
•   4 讨论
• 研究内容二 抗鸡干扰素调节因子7单克隆抗体的研制
•   1 材料
•     1.1 细胞及实验动物
•     1.2 主要试剂
•   2 方法
•     2.1 抗鸡干扰素调节因子7（IRF7）单克隆抗体的制备
•     2.2 单克隆抗体的亚类鉴定
•     2.3 腹水的制备及纯化
•     2.4 单抗的交叉反应性
•     2.5 单克隆抗体识别表位初步分析
•   3 结果
•     3.1 杂交瘤细胞的鉴定
•     3.2 单抗亚类鉴定结果分析
•     3.3 腹水的间接免疫荧光效价分析
•     3.4 单克隆抗体纯化结果分析
•     3.5 chIRF7单抗特异性结果分析
•     3.6 单抗识别表位分析
•   4 讨论
• 全文总结
• 文献参考
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱敏

导师: 秦爱建

关键词: 鸡干扰素调节因子,原核表达,真核表达,单克隆抗体

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 扬州大学

基金: 江苏高校优势学科建设工程资助项目,江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州,225009,国家科技基础性工作专项2013FY113300-4,国家重点研发计划项目(2016YFD0500800)

分类号: Q78

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000295

总页数: 71

文件大小: 5363K

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