肉牛呼吸道疾病综合征的病原检测和IBRV恒温隔绝式荧光PCR方法的建立与应用

论文摘要

牛呼吸道疾病综合征（Bovine respiratory disease complex,BRDC）是一类对养牛业造成严重危害和经济损失的疾病。引起BRDC的病因复杂、病原繁多,包括病毒、细菌和支原体等,运输应激和环境改变等因素是重要诱因。近年来,BRDC已经成为制约国内肉牛养殖的一个重要问题。本研究的目的是调查四川BRDC爆发的肉牛群中病原流行情况,分离鉴定牛传染性鼻气管炎病毒并建立可现场检测该病毒的荧光PCR方法,为肉牛BRDC的防控提供参考,取得了以下成果:1.肉牛呼吸道疾病综合征的病原检测2016年10月2018年3月,采集了四川省爆发BRDC的11个肉牛场108份深部鼻腔棉拭子,采用PCR方法分别检测牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus,IBRV）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhoea Virus,BVDV）、牛冠状病毒（Bovine Coronavirus,BCoV）、牛副流感3型病毒（Bovine Parainfluenza Virus type 3,BPIV3）、牛呼吸道合胞体病毒（Bovine Respiratory Syncytial Virus,BRSV）、牛腺病毒3型（Bovine Adenovirus type 3,BAV3）、牛支原体（Mycoplasma bovis,M.Bovis）、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica,M.haemolytica）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,P.multocida）和睡眠嗜组织菌（Histophilus somni,H.somni）等10种病原,并鉴定M.haemolytica的荚膜血清型。检测结果显示IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BAV3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica、H.somni的阳性率分别为37%、16.7%、4.6%、5.6%、6.5%、24.1%、6.5%、46.3%、5.6%,BRSV未检出;不同牛场检出的病原种类有所差别,但IBRV、M.Bovis和M.haemolytica的平均阳性率和场阳性率较高,且混合感染较严重。荚膜血清6型和1型是M.haemolytica的优势荚膜血清型（38/50）。本研究结果为国内肉牛BRDC的防控提供了参考。首次从国内BRDC样本中检测到H.somni,丰富了国内BRDC的病原谱。2.牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定挑选10份IBRV阳性样本,采用MDBK细胞进行分离鉴定。接种后盲传至4代时,其中一个样本接种的细胞出现细胞圆缩、拉网、聚集成葡萄串样的细胞病变,传至5代后,细胞病变稳定。经PCR方法和间接免疫荧光鉴定,确定该毒株为IBRV,命名为IBRV/2018/SMU6352。空斑纯化后该毒株的病毒滴度为108.25TCID50/mL。自行设计引物扩增获得了分离毒株的完整gB和gC基因序列（GenBank登录号分别为MK654723和MK654724）。基于gB的遗传进化显示该毒株为IBRV-1.2型。与GenBank中2019年3月18日前登录的全部55条完整的IBRV gB基因序列（包括唯一国内完整序列JN787952）比对发现,该毒株gB基因序列在1576-1577位插入6个核苷酸（GCGACG）,导致其氨基酸序列525-526之间插入两个氨基酸（GD）。该插入发生在gB蛋白胞外区,不在T细胞和B细胞识别位点区域,首次在国内IBRV gB基因上发现这种突变现象。与GenBank中2019年3月18日前登录的全部56条完整的IBRV gC基因序列（包括唯一国内序列JN787953）比对发现,该毒株gC基因核苷酸序列存在5个独特的非同义替换（T614C、C712T、A833G、A1190G、A1247G）,导致该蛋白出现5个独特的氨基酸序突变（V205A、R238C、Q278R、E397G、E416G）,可能会影响gC蛋白的免疫原性和该蛋白与细胞肝素样受体结合能力。本实验首次在国内报道分离得到IBRV-1.2型毒株,且该毒株gB和gC氨基酸序列上存在独特的变异,为了解国内IBRV的遗传进化提供了参考,也为进一步的IBRV疫苗研发奠定了基础。3.检测IBRV的恒温隔绝式荧光PCR方法的建立与应用IBRV是OIE和我国进出口及跨省贸易中要求检疫的病原,但目前还未见可用于现场的PCR检测方法。参考OIE推荐的荧光定量PCR方法的引物和探针,通过优化反应体系,首次建立了基于恒温隔绝式荧光PCR（Insulated isothermal PCR,iiPCR）检测IBRV的方法。结果显示该方法只特异性检出IBRV,而对BVDV、BPIV3、BRSV、BAV3、BCoV、M.Bovis、P.multocida和M.haemolytica等无关病原不检出;检测下限为2.4 copies/μL,并具有良好的重复性。对临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR方法的检测结果一致。该方法配合PetNAD核酸萃取试剂盒,从核酸提取到报告检测结果仅需1 h,具有操作简便、快速、可现场化的特点,为IBRV的现场检测提供了一个可靠的方法。对9个省29份商品化冻精检测结果显示,IBRV阳性率为24%（7/29）,表明我国流通的商品化冻精携带IBRV情况普遍,需要加强监管。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 部分中英文对照缩写词表
• 第一章 牛传染性鼻气管炎病毒分子检测方法的研究进展
•   1 牛传染性鼻气管炎病毒主要检测靶基因
•     1.1 gB基因
•     1.2 gC基因
•     1.3 gD基因
•     1.4 gE基因
•     1.5 TK基因
•   2 牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的研究进展
•     2.1 PCR方法
•     2.2 巢式PCR方法
•     2.3 实时荧光PCR方法
•     2.4 多重PCR方法
•   3 小结与展望
• 第二章 肉牛呼吸道疾病综合征的病原检测
•   1 材料
•     1.1 临床样本
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要仪器
•   2 方法
•     2.1 样本处理及核酸提取
•     2.2 检测10 种病原的PCR方法
•     2.3 M.haemolytica荚膜血清型1、2和6 型鉴定方法
•   3 结果
•     3.1 108份深部鼻腔棉拭子样本10 种病原检测结果
•     3.2 M.haemolytica阳性样本1、2和6 荚膜血清型鉴定结果
•   4 讨论
•   5 小结
• 第三章 牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定
•   1 材料
•     1.1 临床样本及细胞系
•     1.2 主要试剂
•     1.3 试验仪器
•   2 方法
•     2.1 样本处理
•     2.2 病毒分离
•     2.3 病毒鉴定
•     2.4 病毒的空斑纯化
•     2.5 病毒毒价测定
•     2.6 完整gB和 gC基因扩增
•   3 结果
•     3.1 病毒分离及PCR方法鉴定结果
•     3.2 间接免疫荧光鉴定结果
•     3.3 病毒空斑纯化
•     3.4 病毒毒价测定
•     3.5 完整gB和 gC基因的获得与拼接
•     3.6 gB基因序列分析
•     3.7 gC基因序列分析
•   4 讨论
•   5 小结
• 第四章 检测IBRV的恒温隔绝式荧光PCR方法的建立与应用
•   1 材料
•     1.1 病毒（菌）株和临床样本
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要仪器
•   2 方法
•     2.1 引物合成
•     2.2 IBRV阳性标准品制备
•     2.3 反应体系的优化
•     2.4 特异性试验
•     2.5 灵敏度试验
•     2.6 重复性试验
•     2.7 临床样本检出情况的比较
•     2.8 核酸提取效果的比较
•     2.9 商品化冻精样本检测
•   3 结果
•     3.1 优化的iiPCR方法反应体系
•     3.2 iiPCR方法特异性试验结果
•     3.3 iiPCR方法灵敏度试验结果
•     3.4 iiPCR方法重复性试验结果
•     3.5 临床样本检出情况的比较结果
•     3.6 核酸提取效果的比较结果
•     3.7 商品化冻精检测结果
•   4 讨论
•   5 小结
• 全文结论与创新点
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张颖慧

导师: 汤承

关键词: 牛呼吸道疾病综合征,病原检测,牛传染性鼻气管炎病毒,分离,恒温隔绝式荧光方法

来源: 西南民族大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西南民族大学

基金: “十三五”国家重点研发计划-牛羊重要疫病诊断与检测新技术研究(2016YFD0500907),国家现代农业产业技术体系四川省肉牛创新团队项目

分类号: S852.653

DOI: 10.27417/d.cnki.gxnmc.2019.000143

总页数: 65

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