论文摘要
核苷三磷酸（NTP）和脱氧核苷三磷酸（dNTP）不仅是重要的生化物质,也广泛应用于医药、食品和科学研究。本文中联合利用冰核蛋白（INP）进行细胞表面展示的核苷酸激酶（INP-N-NMKase）与乙酸激酶（INP-N-ACKase）的多酶合成体系,由核苷酸或脱氧核苷酸（NMP/dNMP）一步式生成NTP/dNTP,其中,偶联了 ACKase/ACP催化的磷酸供体ATP循环再生体系。通过ATP的循环再生,反应起始只需要添加少量（底物浓度1/20,UMP反应时需添加1/5）ATP即可满足反应需求。将来自保加利亚乳杆菌的核苷酸激酶nmk（包括cmk、amk、tmk和umk）基因片段和乙酸激酶ack基因片段分别插入到含有冰核蛋白N端基因inp-n的质粒pET-28a（+）下游,构建表面展示菌E-INP-N-NMK和E-INP-N-ACK,导入到大肠杆菌进行表达。以完整细胞作为催化剂,5mM底物的反应体系中,CTP、dCTP转化率分别为96%、93%,ATP、dATP转化率均达到96%,dTTP转化率为90%,UTP转化率为80%,反应过程中无明显产物降解。表面展示的融合蛋白在37℃下温育,尤其在底物存在下,稳定性得到显著提升,不亚于甚至优于胞内游离酶。并且由于整细胞的特性,通过离心回收重复利用可达8次以上。
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摘要Abstract第1章 前言 1.1 核苷三磷酸类物质简介 1.1.1 核苷三磷酸 1.1.2 脱氧核苷三磷酸 1.2 核苷三磷酸类物质的合成 1.2.1 传统合成方法 1.2.2 基于NTP循环再生的酶法合成 1.3 多酶级联催化体系简介 1.4 完整细胞生物催化研究 1.5 研究目的与流程第2章 联合表面展示的CMKase和ACKase合成dCTP和CTP 2.1 实验材料 2.1.1 菌株与质粒 2.1.2 实验生化试剂 2.2 实验方法 2.2.1 基因组提取 2.2.2 质粒抽提 2.2.3 引物序列设计及质粒构建方案 2.2.4 目的基因的扩增及纯化 2.2.5 PCR纯化产物与质粒双酶切 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳与片段回收 2.2.7 目的片段与质粒的连接 2.2.8 重组质粒的转化及验证 2.2.9 目标蛋白的诱导表达 2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳 2.2.11 蛋白含量检测 2.2.12 酶活检测 2.2.13 CTP和dCTP的生物酶法合成 2.2.14 核苷酸的测定 2.3 实验结果与讨论 2.3.1 SDS-PAGE蛋白电泳分析 2.3.2 重组菌酶活测定 2.3.3 应用完整细胞E-CMK酶法合成（d）CTP 2.3.4 温度对表面展示INP-N-CMKase反应的影响 2.3.5 反应热稳定性研究 2.3.6 表面展示整细胞E-INP-N-CMK添加量对（d）CTP合成的影响 2.3.7 不同磷酸供体对（d）CTP合成的影响 2.3.8 磷酸供体浓度对（d）CTP合成的影响 2.3.9 完整细胞E-NP-N-CMK的重复利用 2.4 本章小结第3章 联合表面展示的AMKase和ACKase合成（d）ATP 3.1 实验材料 3.1.1 菌株与质粒 3.1.2 实验生化试剂 3.2 实验方法 3.2.1 引物序列设计 3.2.2 蛋白含量检测和酶活检测 3.2.3 ATP和dATP的生物酶法合成 3.3 实验结果与讨论 3.3.1 SDS-PAGE蛋白电泳分析 3.3.2 重组菌酶活测定 3.3.3 完整细胞E-AMK催化合成（d）ATP 3.3.4 温度对表面展示INP-N-AMKase反应的影响 3.3.5 反应热稳定性研究 3.3.6 E-INP-N-AMK添加量对（d）ATP合成的影响 3.3.7 不同磷酸供体对（d）ATP合成的影响 3.3.8 磷酸供体浓度对（d）ATP合成的影响 3.3.9 完整细胞E-NP-N-AMK的重复利用 3.4 本章小结第4章 联合细菌表面展示的TMKase和ACKase合成dTTP 4.1 实验材料 4.1.1 菌株与质粒 4.1.2 实验生化试剂 4.2 实验方法 4.2.1 引物序列设计 4.2.2 蛋白含量检测和酶活检测 4.2.3 dTTP的生物酶法合成 4.3 实验结果与讨论 4.3.1 SDS-PAGE蛋白电泳分析 4.3.2 重组菌酶活测定 4.3.3 完整细胞E-TMK催化合成dTTP 4.3.4 温度对表面展示INP-N-TMKase反应的影响 4.3.5 INP-N-TMKase热稳定性研究 4.3.6 应用E-INP-N-TMK完整细胞酶法合成dTTP 4.3.7 不同磷酸供体对dTTP合成的影响 4.3.8 磷酸供体浓度对dTTP合成的影响 4.3.9 整细胞催化剂的重复利用研究 4.4 本章小结第5章 联合表面展示的UMKase和ACKase合成UTP 5.1 实验材料 5.1.1 菌株与质粒 5.1.2 实验生化试剂 5.2 实验方法 5.2.1 引物序列设计 5.2.2 蛋白含量检测和酶活检测 5.2.3 UTP的生物酶法合成 5.3 实验结果与讨论 5.3.1 SDS-PAGE蛋白电泳分析 5.3.2 重组菌酶活测定 5.3.3 完整细胞E-UMK催化合成UDP 5.3.4 温度对表面展示INP-N-UMKase反应的影响 5.3.5 INP-N-UMKase热稳定性研究 5.3.6 表面展示整细胞E-INP-N-UMK添加量对UTP合成的影响 5.3.7 不同磷酸供体对UTP合成的影响 5.3.8 磷酸供体浓度对UTP合成的影响 5.3.9 完整细胞E-NP-N-UMK的重复利用 5.4 本章小结第6章 结论与展望 6.1 结论 6.2 展望参考文献致谢附录Ⅰ
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 丁翌
导师: 欧伶
关键词: 核苷三磷酸,核苷酸激酶,乙酸激酶,表面展示,循环再生
来源: 华东理工大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 华东理工大学
分类号: Q54
DOI: 10.27148/d.cnki.ghagu.2019.000120
总页数: 86
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标签：核苷三磷酸论文; 核苷酸激酶论文; 乙酸激酶论文; 表面展示论文; 循环再生论文;
