靶向NF-κB1基因RNAi对DEV增殖的影响

论文摘要

鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）是威胁和危害水禽养殖产业健康发展的重要病原之一,但其致病机理尚未得到完全阐明。NF-κB分子是动物机体NF-κB信号通路关键分子,在动物多种生物学过程中发挥重要作用,与炎症过程和病毒侵染有关,且NF-κB信号通路的关键调控因子有IL-1β等细胞因子,但有关DEV感染与NF-κB信号通路的关联性,未见研究报道。为此,本研究采用RNAi技术沉默NF-κB1基因,分析NF-κB1基因对DEV增殖影响,以及分析NF-κB信号通路的下游关键调控因子IL-1β的变化,以期为DEV致病机理的揭示提供一些基础依据。1.鸭源IL-1β基因RT-PCR检测方法的建立根据GenBank上鸭源IL-1β基因设计特异性引物,进行PCR扩增得到IL-1β基因片段,回收纯化后连接至pMD19-T载体,转化至大肠杆菌并增菌,提取重组质粒进行鉴定,以重组质粒为模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测并进行特异性、重复性和敏感性检验,结果显示:建立的鸭源IL-1β基因荧光定量PCR方法扩增曲线良好,标准曲线方程y=-3.329x+39.731,扩增效率为99.7%,相关系数为1;该荧光定量PCR方法检测的批内重复变异系数小于2%,批间重复变异系数小于3%;该方法的检测灵敏度达1.74×101copies·μL-1,为普通PCR方法的100倍,熔解曲线无杂峰,说明特异性良好。这些结果表明本研究成功建立了鸭源IL-1β基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。2.DEV感染鸭组织器官IL-1β基因转录变化分析选取40d健康鸭60只,随机分为2组即感染组和正常组,感染组肌肉接种DEV而正常组注射生理盐水,于处理后第12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h时捕杀实验鸭,采集心、肝、脾、肺、肾、脑、十二指肠、气管、肌肉、法氏囊、胸腺和胰腺,提取组织DNA和mRNA样本,以实验室前期建立的DEV NP基因普通PCR方法进行DEV鉴定,以上述RT-PCR方法进行IL-1β1基因的转录水平检测。结果显示:感染组鸭组织器官均检测到DEV NP基因正常组均未检出,说明DEV感染成功;感染组鸭组织器官IL-1β基因转录水平不同时段上升且高于正常组,其中72h时肺脏、脾脏和肾脏IL-1β转录水平上调幅度最大,达正常组100倍以上。这些结果表明,DEV感染能显著上调IL-1β转录水平。3.靶向NF-kB1基因RNAi对DEV增殖及主要细胞因子分泌的影响取本实验室前期构建的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-NF-kB1-14,转染DEF细胞进行沉默效果分析并检测重组质粒对细胞增殖的影响;将病毒感染与质粒转染以三种方法处理DEF细胞细胞,即先接毒24h后转染质粒、先转染质粒24h后接毒和同时进行接毒及质粒转染,于处理后第36h、48h、60h和72h时观察转染荧光情况;同时采用RT-PCR方法检测DEV-NP基因及IL-1β基因转录水平,ELISA方法检测NF-κB信号通路下游因子IL-1β、myD88、TNFα、IL-6和IL-8分泌情况,结果显示:重组质粒pGPU6/GFP/Neo-NF-kB1-2干扰效率达78.77%,沉默效果最好;干扰重组质粒对DEF细胞存活的影响不大;在三个处理组中,与DEV实验组比较,先接毒后转染组对DEV增殖影响差异不显著,而先转染后接毒组和同时接毒转染组均对DEV增殖均呈现明显的抑制作用,其中第48h以同时接毒转染组的沉默效果最好,沉默效率达83%,而第72h以先转染后接毒组的沉默效果最好,沉默效率达77%;IL-1β转录水平在DEV感染组呈先上升后下降趋势,在RNAi干扰组呈先降低后升高趋势,而在RNAi干扰+DEV感染组均低于RNAi干扰组和DEV组;在不同处理组中,NF-κB下游因子表达水平在不同时间段呈现出一定的变化,其中IL-1β的表达在先转染后接毒组和同时接毒转染组中变化规律相似,都在干扰重组质粒对照组中36h、48h、60h均低于正常组,在DEV对照组于36h、60h、72h高于正常组,在干扰重组质粒+DEV组呈现先上升后下降的反复变化。这些结果表明,RNA干扰NF-kB1基因,能抑制DEV增殖并影响NF-κB信号调理下游因子的分泌。综上所述,本研究成功建立了鸭源IL-1β基因荧光定量PCR方法;DEV感染可导致宿主细胞IL-1β基因转录水平上调;RNA干扰NF-kB1基因,能抑制DEV的增殖并影响NF-κB信号通路下游因子的分泌。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 略缩词
• 文献综述
•   1 DEV概况
•     1.1 DEV形态结构特征
•     1.2 DEV增殖过程
•     1.3 DEV致病特征及防控
•   2 NF-κB信号通路概况
•     2.1 NF-κB家族成员
•     2.2 NF-κB信号通路的激活
•     2.3 NF-κB信号通路与病原体感染
•   3 RNAi技术概况
•     3.1 RNAi技术简介
•     3.2 RNAi作用机制
•     3.3 RNAi技术应用
• 实验研究
•   前言
•   1 材料
•     1.1 实验动物
•     1.2 毒株和质粒
•     1.3 主要试剂
•     1.4 主要仪器
•   2 方法
•     2.1 IL-1β实时荧光定量PCR方法的建立
•       2.1.1 IL-1β引物合成
•       2.1.2 IL-1β PCR扩增
•       2.1.3 标准质粒构建
•       2.1.4 荧光定量PCR方法建立
•     2.2 DEV感染后鸭各组织IL-1β的变化
•       2.2.1 人工感染及样品采集
•       2.2.2 DEV-NP基因PCR检测
•       2.2.3 IL-1β基因的转录水平变化
•     2.3 NF-κB1 sh RNA质粒的筛选
•       2.3.1 鸭胚成纤维细胞的制备与培养
•       2.3.2 干扰重组质粒转染DEF细胞
•       2.3.3 NF-κB1基因转录情况检测
•       2.3.4 干扰重组质粒对DEF细胞自身的影响
•     2.4 NF-κB1 RNAi对DEF细胞中DEV增殖的影响
•       2.4.1 DEV和干扰重组质粒处理DEF细胞
•       2.4.2 DEV-NP基因的检测
•       2.4.3 NF-κB关键因子IL-1β的检测
•       2.4.4 NF-κB通路下游因子的检测
•   3 结果
•     3.1 IL-1β实时荧光定量PCR方法的建立
•       3.1.1 IL-1β基因标准质粒的构建
•       3.1.2 荧光定量PCR方法建立结果
•       3.1.3 重复性、敏感性、特异性检验
•     3.2 DEV感染后鸭各组织IL-1β转录变化
•       3.2.1 DEV-NP基因PCR检测结果
•       3.2.2 IL-1β基因转录水平变化
•     3.3 干扰重组质粒筛选
•       3.3.1 干扰重组质粒干扰效率比较
•       3.3.2 干扰重组质粒对DEF细胞的影响
•     3.4 NF-κB1 RNAi对DEV在DEF细胞中增殖的影响
•       3.4.1 干扰重组质粒转染荧光观察
•       3.4.2 DEV-NP基因的检测
•       3.4.3 NF-κB关键因子IL-1β的检测
•       3.4.4 NF-κB通路下游因子的检测
•   4 分析与讨论
•     4.1 关于DEV感染后鸭组织中IL-1β的检测
•     4.2 NF-κB与IL-1β的关系
•     4.3 NF-κB与DEV的关系
•     4.4 NF-κB与机体正常细胞生长的关系
•   5 展望
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 贺欣薇

导师: 文明

关键词: 信号通路,干扰,基因,增殖

来源: 贵州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 贵州大学

基金: 国家自然科学基金项目“NF-κB信号调控鸭场炎病毒增殖过程的分子机制研究”(31560703),贵州省科技创新人才团队建设项目“贵州省动物疫病防控与兽医公共卫生保障科技创新人才团队”(黔科合人才团队[2015]4016号),贵州省科技平台及人才团队计划项目“贵州省动物生物制品工程技术研究中心”(黔科合平台人才[2018]5253号)

分类号: S852.65

总页数: 68

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