外切型琼胶酶AgaO的高效表达及酶学性质表征

论文摘要

根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化外切型琼胶酶AgaO的基因并人工全合成,克隆入表达载体质粒pET-30a（+）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,优化表达条件即诱导温度、诱导时间和诱导剂IPTG终浓度,纯化重组蛋白rEAgaO,并分析其酶学性质变化。结果表明,重组酶rEAgaO在16℃、IPTG终浓度0.1 mmol/L条件下诱导20 h时表达量最高;95%以上的重组蛋白质为水溶性表达,产量约为1432.7 mg/L,较优化前原始基因的产量提高了10.9倍;重组酶rEAgaO的最适反应温度为45℃,在低于40℃的温度下预处理2 h后,仍然具有90%以上的残余活性,最适pH为7.0,在pH6.0～10.0不同缓冲体系4℃处理2 h仍保留69.5%以上的活性;该酶降解琼脂糖后的最终产物经TLC分析鉴定为新琼二糖。基因密码子优化虽不改变蛋白质氨基酸序列,但可明显提高水溶性重组蛋白质的产率及酶活,对促进相关酶类的生产和应用具有借鉴意义。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料与仪器
•   1.2 实验方法
•     1.2.1 EAgaO密码子的优化和人工合成
•     1.2.2 重组表达载体pET30a-EAgaO的构建及鉴定
•     1.2.3 琼胶酶rEAgaO的诱导表达
•     1.2.4 重组酶表达条件的单因素优化
•       1.2.4.1 诱导时间对重组酶诱导表达的影响
•       1.2.4.2 诱导温度对重组酶诱导表达的影响
•       1.2.4.3 诱导剂IPTG终浓度对重组酶诱导表达的影响
•     1.2.5 琼胶酶rEAgaO的纯化
•     1.2.6 酶活测定
•     1.2.7 琼胶酶rEAgaO的酶学性质分析
•       1.2.7.1 酶的最适温度及热稳定性测定
•       1.2.7.2 酶的最适pH及pH稳定性测定
•       1.2.7.3 金属离子和化学试剂对酶活力影响的测定
•     1.2.8 降解产物的分析
•   1.3 数据处理
• 2 结果与分析
•   2.1 琼胶酶基因eagaO重组表达载体的构建与验证
•   2.2 重组酶表达条件的单因素优化
•     2.2.1 诱导时间对诱导产酶酶活的影响
•     2.2.2 诱导温度对诱导产酶酶活的影响
•     2.2.3 IPTG浓度对诱导产酶酶活的影响
•   2.3 琼胶酶rEAgaO的分离纯化
•   2.4 琼胶酶rEAgaO的酶学性质分析
•     2.4.1 温度对rEAgaO活性及稳定性的影响
•     2.4.2 pH对rEAgaO活性及稳定性的影响
•     2.4.3 金属离子及化学试剂对rEAgaO活性的影响
•   2.5 降解产物的分析
• 3 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 程媛媛,陈庆敏,李俊鸽,李淑焕,王延辉,韩文君

关键词: 琼胶酶,密码子优化,原核表达,酶学性质,新琼二糖

来源: 食品工业科技 2019年07期

年度: 2019

分类: 工程科技Ⅰ辑,基础科学

专业: 生物学

单位: 山东农业工程学院食品科学与工程学院山东省教育厅特色农产品采后品控与综合利用重点实验室,山东大学国家糖工程技术研究中心糖化学与生物学山东省重点实验室

基金: 山东省重点研发计划项目(2018GHY115036),山东省高等学校科技计划项目(J18KZ009),微生物技术国家重点实验室开放课题(M2018-02),山东农业工程学院青年教师科研项目(QNKJZ201801),国家自然科学基金青年科学基金项目(31300664)

分类号: Q55;Q78

DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2019.07.019

页码: 107-113

总页数: 7

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