大豆U6启动子活性分析及其在基因编辑中的应用

论文摘要

大豆是世界第四大作物,是重要的经济作物,在农业中占有重要地位。大豆是农作物中蛋白质含量最高的作物,蛋白质含量高达35%-40%;大豆作为优质的食用油,出油率在18%-20%,是人类蛋白质和食用油的重要来源。除此之外,大豆还可以作为饲料,工业产品的原材料;大豆种子还可以加工成多种食物产品,如冲调饮用蛋白制品和添加剂用蛋白制品等。大豆产量需求的持续增加,迫使需要优质、高产、抗逆性强的大豆品种。利用CRISPR-Cas9可以快速高效的实现大豆品种的改良。在CRISPR-Cas9系统中,U6启动子常被用于驱动sgRNA的转录,是CRISPR-Cas9系统中重要的元件。适用于大豆且能够高效转录的大豆U6启动子尚未报道,而亲缘关系较远的物种间的U6启动子不一定适用。因此本研究的目的:筛选具有较高转录活性和编辑效率的大豆U6启动子。方法:本研究克隆了大豆11个U6启动子,通过驱动GUS基因的表达对大豆U6启动子在大豆发状根和拟南芥中的转录活性进行了分析。同时选取4个大豆基因作为基因编辑的目的基因,诱导大豆形成发状根,通过DNA聚合酶链式反应和限制性内切酶酶切（RE-PCR）检测大豆目的基因的突变效率,筛选出具有最高效编辑效率的大豆U6启动子,可以用于敲除或沉默大豆相关功能基因,从而获得营养丰富或优质的大豆,为CRISPR-Cas9系统在大豆分子育种中的应用提供基础。主要研究结果如下:1.在大豆全基因组水平上克隆了11个GmU6启动子,片段大小分别为352bp,256 bp,342 bp,236 bp,342 bp,257 bp,279 bp,314 bp,280 bp,306 bp,294 bp。基于11个GmU6启动子构建了p3301-GUS-GmU6-1p3301-GUS-GmU6-11真核表达载体,并用于植物转化。2.本研究通过农杆菌K599介导的转化大豆发状根和农杆菌GV3101转化拟南芥,系统地分析和比较了11个GmU6启动子的转录活性。结果我们发现,在大豆发状根中GmU6-1,GmU6-4,GmU6-7,GmU6-8,GmU6-10和GmU6-11启动子的转录水平都明显高于GmU6-5启动子;而在拟南芥中GmU6-2,GmU6-3,GmU6-4,GmU6-7,GmU6-8,GmU6-10和GmU6-11转录活性都高于GmU6-5启动子。综合11个U6启动子在豆子发状根和拟南芥叶片中的相对表达水平来看,GmU6-4,GmU6-7,GmU6-8,GmU6-10和GmU6-11启动子转录活性相对较高。3.本研究中,我们选取了大豆四个基因作为基因编辑的靶基因,并且为每个基因分别设计了对应的sgRNA。最终构建了Glyma06g14180-pCas9-GmU6-1Glyma06g14180-pCas9-GmU6-11,Glyma03g36470-pCas9-GmU6-1Glyma03g36470-pCas9-GmU6-11,Glyma11g253000-pCas9-GmU6-1Glyma11g253000-pCas9-GmU6-11,Glyma14g04180-pCas9-GmU6-1Glyma14g04180-pCas9-GmU6-11,共44个载体,并用作大豆发状根的转化。4.通过PCR-RE方法检测44个载体转化的大豆发状根的突变情况,结果发现11个GmU6启动子在不同的基因中发生的突变类型是不一样的,Glyma03g36470、Glyma14g04180和Glyma11g253000涉及的突变类型主要是碱基的缺失,而Glyma06g14180的突变类型大多数是碱基插入和缺失。GmU6-8和GmU6-10启动子在Glyma06g14180,Glyma03g36470,Glyma14g04180三个基因中的编辑效率分别为22.1%,26.6%,12.1%;20.5%,14.7%,15.9%。结合11个GmU6启动子在大豆发状根和拟南芥中的转录活性,我们发现GmU6-8和GmU6-10启动子在CRISPR-Cas9系统中的基因编辑效率相对较高（平均突变率分别为20.3%和20.6%）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 绪论
•   1.1 大豆的生产现状和应用
•   1.2 基因编辑技术
•   1.3 CRISPR-Cas9 基因编辑技术
•     1.3.1 CRISPR-Cas9 基因编辑技术的发展
•     1.3.2 CRISPR-Cas9 基因编辑技术的结构和原理
•     1.3.3 CRISPR-Cas9 基因编辑技术在植物基因功能中的研究进展
•     1.3.4 CRISPR-Cas9 基因编辑技术在作物改良中的应用
•     1.3.5 CRISPR-Cas9 基因编辑技术在食品中的应用
•   1.4 基因编辑特异性
•   1.5 CRISPR-Cas9 基因编辑的效率
•   1.6 研究主要内容
•   1.7 技术路线
•   1.8 研究目的及意义
• 第二章 大豆U6启动子克隆和活性分析
•   2.1 材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 菌株与载体
•     2.1.3 酶和其它试剂
•     2.1.4 试剂盒
•     2.1.5 引物合成及测序
•   2.2 方法
•     2.2.1 大豆U6 启动子的克隆
•     2.2.2 大豆U6 启动子表达载体构建
•     2.2.3 大豆U6 启动子植物转化
•     2.2.4 大豆U6 启动子转录活性
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 GmU6 启动子扩增产物的鉴定
•     2.3.2 GmU6 启动子表达载体的构建
•     2.3.3 GmU6 启动子转录活性分析
•     2.3.4 讨论
•   2.4 本章小结
• 第三章 大豆U6启动子基因编辑效率分析
•   3.1 材料
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 菌株与载体
•     3.1.3 酶和其它试剂
•     3.1.4 试剂盒
•     3.1.5 引物合成及测序
•   3.2 方法
•     3.2.1 CRISPR-Cas9 表达载体构建
•     3.2.2 CRISPR-Cas9 表达载体植物转化
•   3.3 大豆U6 启动子在基因编辑中突变效率检测
•     3.3.1 大豆发状根基因组DNA提取
•     3.3.2 CRISPR-Cas9 编辑的检测
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 CRISPR-Cas9 表达载体构建
•     3.4.2 大豆发状根突变效率检测
•     3.4.3 讨论
•   3.5 本章小结
• 结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 攻读硕士学位期间发表的论文和科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 邸一桓

导师: 赵山山,张辉,胡正

关键词: 大豆,启动子,基因编辑

来源: 河北工程大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 河北工程大学

分类号: S565.1;Q943.2

DOI: 10.27104/d.cnki.ghbjy.2019.000165

总页数: 67

文件大小: 2364K

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