（贵阳中医学院第一附属医院检验科贵州贵阳550001）
【摘要】目的：了解我院流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌对常用抗菌药物的耐药性和对氨苄西林的耐药机制，以便指导临床医生合理选择抗生素及防治院内感染。方法：采用MIC法和头孢硝噻吩纸片法，回顾分析2015年1月1日至2017年2月1日两年来我院患者临床标本中分离出的93株流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌的耐药表型。结果：2015年—2017年93株嗜血杆菌患者，年龄分布主要为60～99岁，下呼吸道标本中的流感嗜血杆菌检出率为1.28%，副流感嗜血杆菌的检出率为1.27%。流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率为74.47%，副流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率为47.83%。93株流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌中，57株氨苄西林耐药，其中44株?-内酰胺酶阳性，且氨苄西林均耐药，13株?-内酰胺酶阴性但氨苄西林耐药。流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌均对环丙沙星，四环素，头孢曲松，左氧氟沙星，利福平，美洛培南耐药率低<15%,对复方磺胺耐药率高>80%。结论：流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌对复方磺胺耐药率最高，其次对氨苄西林耐药率高。?-内酰胺酶阳性的流感或副流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药的主要耐药机制是产biaTEM型?-内酰胺酶。
【关键词】流感嗜血杆菌；副流感嗜血杆菌；下呼吸道；氨苄西林；?-内酰胺酶耐药表型
【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2017）16-0156-03
老年人主要有基础疾病和医源性两方面的原因从而诱发内源性感染和外源性感染。因此，对老年患者提高流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌的检出率及时诊断与治疗具有重要的意义。本文回顾性分析了本院2015年至2017年两年来流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌耐药率和耐药表型，旨在为临床合理选择抗菌药物提供参考。
1.资料与方法
1.1菌株的来源
2015年1月—2017年2月在我院住院老年患者(年龄60岁至99岁)，剔除重复菌株，从合格下呼吸道标本中培养出流感嗜血杆菌47株，副流感嗜血杆菌46株。
1.2标本的采集
（1）下呼吸道标本的采集：温开水嗽口，深呼吸咳深部痰液于无菌杯中送检，晨痰最佳。（2）下呼吸标本的筛查标准：痰涂片革兰氏染色白细胞>=25个/高倍镜，上皮细胞<=10个/低倍镜视为合格的下呼吸道标本。如果白细胞<=10个/高倍镜，上皮细胞>=25个低倍镜视为不合格的下呼吸道标本。（3）下呼吸标本的接种和孵育：接哥伦比亚血琼脂平板，麦康凯琼脂平板，嗜血杆菌巧克力琼脂平板，在CO25%～10%的环境下，35℃，孵育18～24小时。（4）致病菌与定植菌（或污染菌）的区分：下呼吸道，咽拭子，肺胞灌洗液标本，痰涂片查见细胞内有革兰氏阴性细小，短杆菌视为致病菌，未查见则为定植菌。
1.3菌株的分纯与鉴定
临床接种的标本经培养后，对可疑菌落（嗜血巧克力培养基的特征为：圆形，湿润，光滑或粗糙，露滴样，无色至灰白色，有荚膜的菌株可呈黏液性菌落，有鼠穴气味）行革兰染色涂片镜检：革兰氏阴性小杆菌；并且“卫星试验阳性”（在金黄色葡萄球菌周围出现被检菌的菌落较大，而远离金黄色葡萄球菌的菌落小或不生长）的菌株进行分离纯培养，综上结合菌落形态，革兰氏染色镜检，卫星试验可初步定为嗜血杆菌，最后由湖南长沙公司细菌分析仪进行鉴定与药敏试验。
1.4药敏的方法
采用CLSI推荐的MIC法作药敏试验和观察结果，以流感嗜血杆菌ATCC49247，流感嗜血杆菌ATCC49766，大肠埃希菌ATCC35218（监控阿莫西林/克拉维酸）作质控。药敏结果标准解释参照CLSI2012第二十二版信息增刊。
1.5统计学处理
采用WHONET5.6进行数据处理。
2.结果
2.1流感嗜血杆菌耐药率监测(表1)
表1
2.3流感嗜血杆菌和副流感嗜杆菌的耐药表型检测(表3)
表3
3.讨论
3.1嗜血杆菌属细菌寄生在人和多种动物的黏膜，在人体内主要寄生在咽喉及口腔黏膜，少见于消化道和生殖道，主要引起人类疾病的嗜血杆菌有流感嗜血杆菌，副流感嗜血杆菌，其它的嗜血杆菌：埃及嗜血杆菌，杜克雷嗜血杆菌，嗜沫凝聚杆菌很少引起感染。其中，流感嗜血杆菌主要引起人类急性化脓感染如：急性咽炎，喉炎，肺炎，鼻窦炎，心内膜炎，脑膜炎，败血症等及严重的继发感染。特别是：老年人的抵抗力下降又合并基础疾病，如支气管的扩张，慢性支气管炎，慢性阻塞性肺病等时，流感嗜血杆菌可侵入下呼吸道，加重基础疾病的病情[1]。副流感嗜血杆菌引起的感染分为原发性感染和继发性感染，原发性感染主要通过呼吸道传播，多见于儿童，继发性感染主要寄居于上呼吸道的无荚膜菌株所致，多见于老年人[2]。老年人主要有基础疾病和医源性两方面的原因从而诱发内源性感染和外源性感染。因此，对老年患者提高流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌的检出率及时诊断与治疗具有重要的意义。
3.2长期以来，氨苄西林一直作为治疗流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌感染的首选药物，但随着氨苄西林等?-内酰胺类抗生素的产泛应用，耐药菌株开始出现，且耐药率排第二位，仅次于复方磺胺。从表一看出流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率达74.47%，从表二看出副流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率达47.83%，流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率明显高于副流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率，并且流感嗜血杆菌出现了多重耐药菌株，对3类及3类以上抗菌药物同时耐药的菌株称为多重耐药株(MDR)，对所有代表性抗菌药物均耐药的菌株称为全耐药菌株(PDR)[3]。本文只分析多重耐药菌株，耐药表型分析如下：流感嗜血杆菌MDR占25.53%，副流感嗜血杆菌MDR占10.87%，它们的主要耐药模式为AMT+SXT+CHZ，主要对氨苄西林，复方磺胺甲恶唑，头孢类药物的联合耐药，MDR的出现给临床治疗带来了极大的困难，临床医生应根据药敏结果合理选用抗菌药物，避免滥用抗生素。
3.3从表三可以看出
?-内酰酶阳性的流感嗜血杆菌有28株，副流感嗜血杆菌有16株。?-内酰胺酶阴性的流感嗜血杆菌有19株，副流感嗜血杆菌有30株。由此，可以看出：?-内酰酶阳性的流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药率为100%，?-内酰酶阳性氨苄西林耐药率为77.2%，说明：产?-内酰胺酶是流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌的耐氨苄西林的主要机制，其?-内酰胺酶阳性的流感或副流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药的耐药机制是：产生TEM型?-内酰胺酶和ROB型?-内酰胺酶[4]，其中质粒介导产生的TEM型酶是流感嗜血杆菌的主要耐药酶，?-内酰胺酶阳性菌株可能对氨苄西林，阿莫西林和青霉素均耐药，且绝大多数耐药株可产生biaTEM型?-内酰胺酶。
3.4从表四可以看出
?-内酰胺酶阴性而氨苄西林耐药嗜血杆菌很少见，其中流感嗜血杆菌7株，副流感喷嗜血杆菌6株，其?-内酰胺酶阴性的流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药的耐药机制是：由于染色体介导的青霉素结合蛋白的改变和外膜蛋白通透性下降所致。此类菌株在临床上称为BLNAR[5](?-内酰胺酶阴性，氨苄西林耐药的流感嗜血杆菌株)，本次检测共发现7株BLNAR。其?-内酰胺酶阴性副流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药的耐药机制有待下一步研究。
3.5从表五可以看出
BLNAR菌少见只有7株，我们的检测方法是双纸片法:采用氨苄西林(10微克/片)和阿莫西林/克拉维酸(30微克/片)双纸片结合的方式。KB法显示如果氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸均耐药提示该细菌可能为BLNAR。这类细菌就认为对：阿莫西林/克拉维酸，氨苄西林/舒巴坦，头孢克罗，头孢孟多，头孢他美，头孢尼西，头孢呋辛耐药，即使某些BLANR的菌株对上述药物体外显示为敏感。BLNAR细菌耐药基因的检测有待下一步的研究。
综上所述，随着抗菌药物的用量和时间的推移的关系，流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌的耐药性会发生改变，因此，用药过程中应定期进行细菌培养，尤其是60岁以上的老年患者，随时调整抗菌药物的种类和用量。微生物实验室应加强和重视流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌的鉴定和培养及耐药性监测工作以指导临床医生合理使用抗菌药物。
【参考文献】
[1]KingPT,sharmaR,ThelungimmuneresponsetonontypeableHaemaphilusinfluenzae(LungImmunitytoNT-Hi)[J].JImmunolRes,2015,26(16):1036-1042.
[2]张桂玉，刘小平.副流感嗜血杆菌在慢性阻塞性肺疾病老年患者痰液中的分离率及耐药性[J].中国老年学杂志，2013，33(5)：2128-2130.
[3]FalagasME,KarageorgopoulosDE.Pardrugresistance(PDR),ex-tensivedrugresistance(PDR),andmultidrugresistance(MDR)amongGranm-negativebacill;needforinternationalharmomiza-tioninterminolory[J]ClinInfectDis,2008,46（7）:1121-1122.
[4]KimIS,KiCS,KimS,etal.persityofampicellinresistanceGenesandantimicrobialsusccptibilitypattemsinHae-mophilusinfluenzaestrainsisolatedinKorea[J].AntimicrobAgentschemother,2007,51(2):453-460.
[5]陈东科，孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱.796-797.