猪NLRP6基因表达载体构建及其多克隆抗体的制备

论文摘要

核苷酸结合寡聚化结构域受体（NOD-like receptors,NLRs）是先天性免疫中病原识别受体之一,在机体防御中起着重要作用。NLRP6是NOD样家族中一类作用机理比较特别的蛋白,在免疫中的作用与其调节caspase-1和NF-κB活性的能力有关。本试验以猪NLRP6基因为研究对象。依据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号:XM-003124236.4）设计特异性引物,利用PCR从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增获得NLRP6基因,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a（+）中,获得重组表达质粒pET-32a-NLRP6,通过抗性筛选、酶切、PCR鉴定重组质粒。将重组质粒pET-32a-NLRP6转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞,IPTG诱导其高效表达,获得分子量大小约为34KDa的以包涵体形式存在的NLRP6重组融合蛋白,Western blot结果表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。NLRP6重组融合蛋白经镍离子柱纯化、变性和复性后,即获得了可溶性NLRP6重组融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原,按合理免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠,制备多克隆抗体,多抗血清经Western blot鉴定其特异性,结果显示鼠抗NLRP6多克隆抗体可以特异性识别NLRP6蛋白。本试验利用原核表达系统成功制备了NLRP6蛋白,并制备了免疫活性和特异性良好的鼠抗NLRP6多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 引言
•   1.1 模式识别受体
•   1.2 炎性小体的研究
•   1.3 NLRP6 样受体研究进展
•   1.4 本实验研究的目的与意义
• 第二章 NLRP6 重组表达载体的构建
•   2.1 试验材料与方法
•   2.2 氯化钙法制备大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞
•   2.3 重组原核表达载体构建
•   2.4 重组质粒pET-32a-NLRP6 在大肠杆菌中表达
•   2.5 结果与分析
•   2.6 讨论
• 第三章 NLRP6 重组蛋白诱导表达及其多克隆抗体制备
•   3.1 试验材料
•   3.2 重组蛋白诱导表达条件优化及鉴定
•   3.3 重组蛋白的可溶性分析及纯化
•   3.4 鼠抗NLRP6 多克隆抗体制备
•   3.5 结果与分析
•   3.6 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨文静

导师: 杨升,乔家运

关键词: 猪蛋白,克隆,原核表达,多克隆抗体

来源: 天津农学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 天津农学院

基金: 国家自然科学基金(31702147)

分类号: Q78

总页数: 52

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