Ghrelin通过促自噬作用抑制高糖高脂诱导的胰岛β细胞凋亡

论文摘要

有研究发现胃饥饿素（Ghrelin）在保护胰岛β细胞方面有作用,它可以减少胰岛细胞在长期高糖、高脂状态下的凋亡,增加细胞活性。另一方面,ghrelin也被用于细胞自噬方面的研究,它可以诱导保护性自噬,保护心肌细胞免受氧化应激缺氧损伤,在癌细胞研究方面又可通过诱导自噬来抑制癌细胞的扩散。总的来说,ghrelin对胰岛β细胞有保护性,但这种保护性是否与自噬相关,及ghrelin对胰岛β细胞是否有促自噬作用并不清楚,若其有促自噬作用,那么又是否能通过这一作用来降低凋亡的发生?因此本实验想通过构建体外高糖高脂环境诱导细胞凋亡模型来研究（1）ghrelin是否能增强细胞的自噬作用;（2）ghelin在保护胰岛细胞方面是否与其促细胞自噬作用相关;（3）ghrelin在调节高糖高脂环境下细胞的凋亡及自噬间的相互作用。为临床保护胰岛功能功能和糖尿病的用药提供新的实验理论基础。第一部分高糖高脂诱导胰岛NIT-1细胞凋亡模型构建目的:构建体外高糖高脂环境诱导细胞凋亡模型,为后续实验提供基础。方法:以葡萄糖和棕榈酸PA构建体外高糖高脂环境诱导细胞凋亡模型,分组为:正常对照组（葡萄糖5.6 mmol/L+0.5%BSA）、高糖高脂模型组（葡萄糖33.3 mmol/L+0.5%BSA+0.5 mmol/LPA）。检测凋亡模型是否构建成功:（1）用CCK-8检测胰岛细胞增值的活性。（2）用Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术检测细胞凋亡率。（3）Hoechst 33258染色标记细胞核观察细胞凋亡形态。（4）qPCR测定各组Bcl-2、BaxmRNA表达量的变化。结果:高糖高脂诱导细胞凋亡模型成功,（1）通过CCK活性检测显示,高糖高脂组比正常对照组细胞活性减少（P<0.05）。（2）Annexin V-FITC/PI双染测定细胞总凋亡率及Hoechst 33258显示,与正常对照组比较,高糖高脂组凋亡增加（P<0.05）。（3）高糖高脂诱导后下调Bcl-2表达（P<0.05）,上调Bax表达（P<0.05）。结论:通过33.3 mmol/L浓度葡萄糖和0.5 mmol/L棕榈酸构建高糖高脂环境诱导胰岛β细胞凋亡模型成功,为后续实验提供基础。第二部分 Ghrelin对糖脂毒性下胰岛β细胞凋亡及自噬的影响目的:探讨ghrelin对胰岛β细胞凋亡及自噬的作用。方法:首先构建体外高糖高脂环境诱导细胞凋亡模型,并以ghrelin干预分为不同处理组:正常对照组（葡萄糖5.6mmol/L+0.5%BSA）、ghrelin对照组（葡萄糖 5.6 mmol/L+0.5%BSA+100nmol/L ghrelin）、高糖高脂模型组（葡萄糖33.3 mmol/L+0.5 mmol/LPA）、高糖高脂+ghrelin处理组（葡萄糖 33.3 mmol/L+0.5 mmol/LPA+100 nmol/L ghrelin）。（1）用 CCK-8 检测胰岛细胞增殖活性。（2）检测凋亡:Annexin V-FITC/PI双染流式检测凋亡率,Hoechst33258 染核,qPCR 测 Bcl-2、BaxmRNA 表达。（3）检测自噬:MDC自噬空泡荧光染色,自噬蛋白LC3B免疫荧光,电镜检测自噬体,Western Blot检测各处理组自噬相关蛋白Beclin-1,P62,LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ转化率,qPCR检测Atg6、LC3B mRNA表达。结果:（1）正常对照组与ghrelin对照组细胞活性无显著差异;与高糖高脂组比较,高糖高脂+ghrelin组细胞活性增加（P<0.05）。（2）Annexin V-FITC/PI双染测定细胞总凋亡率及Hoechst 33258显示,与正常对照组比较,ghrelin对照组细胞凋亡减少（P<0.05）,但Bax、Bcl-2表达无显著差异。在高糖高脂基础上,ghrein应用后细胞凋亡降低（P<0.05）,上调Bcl-2表达（P<0.05）,下调Bax表达（P<0.05）。（3）MDC染色及自噬蛋白LC3B免疫荧光及电镜结果显示,与正常对照组比较,ghrelin对照组及高糖高脂组自噬增加。高糖高脂组Beclin-1蛋白,LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ转化率,P62蛋白及Atg6、LC3B mRNA表达均增加（P<0.05）;ghrelin对照组Beclin-1蛋白表达增加（P<0.05）。与高糖高脂组比较,高糖高脂+ghrelin组自噬进一步增加。Ghrelin上调糖脂毒性下细胞Beclin-1蛋白,LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ转化率及Atg6、LC3B mRNA表达（P<0.05）,P62蛋白表达无统计学差异。结论:（1）高糖高脂诱导细胞凋亡发生的同时使细胞自噬增强,可能与其自噬启动产生增多和降解减少相关。（2）ghrelin可抑制高糖高脂诱导的细胞凋亡,对细胞产生保护作用,避免糖脂毒性损伤。（3）ghrelin对正常条件下的胰岛细胞自噬无影响,但会加强糖脂毒性作用下的细胞自噬。第三部分 自噬在ghrelin抗胰岛β细胞凋亡中的作用目的:研究ghrelin在调节糖脂毒性下细胞的凋亡及自噬间的相互作用。方法:以ghrelin和氯喹CQ干预糖脂凋亡模型分为不同处理组:高糖高脂模型组（葡萄糖33.3 mmol/L+0.5 mmol/LPA）、高糖高脂+ghrelin处理组（葡萄糖 33.3 mmol/L+0.5 mmol/LPA+100 nmol/Lghrelin）、高糖高脂+CQ 处理组（葡萄糖 33.3 mmol/L+0.5 mmol/LPA+25 μmol/LCQ）、高糖高脂+ghrelin+CQ 处理组（葡萄糖 33.3 mmol/L+0.5 mmol/LPA+100 nmol/L ghrelin+25 μmol/LCQ）。分别检测细胞活性,凋亡,自噬情况,方法同第二部分。结果:氯喹抑制细胞活性,逆转ghrelin对细胞的保护性。应用自噬抑制剂氯喹后细胞自噬被阻断,表现自噬泡、溶酶体及自噬蛋白LC3B的堆积,P62表达增加。由于自噬降解途径被阻断,联合应用ghrelin和氯喹后,相较于高糖高脂+ghrelin组,细胞凋亡增加,活性下降,ghrelin的抗凋亡作用被抑制。结论:当ghrelin的促自噬作用被阻断时细胞凋亡增加,有理由认为ghrelin对胰岛β细胞自噬的促进作用可调节其对抗糖脂毒性诱导的细胞凋亡。

论文目录

• 个人简历
• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略表
• 前言
• 第一部分 高糖高脂诱导胰岛NIT-1细胞凋亡模型构建
•   一、研究背景
•   二、材料与方法
•   三、实验结果
•   四、讨论
•   五、结论
• 第二部分 Ghrelin对糖脂毒性下胰岛β细胞凋亡及自噬的影响
•   一、研究背景
•   二、材料与方法
•   三、实验结果
•   四、讨论
•   五、结论
• 第三部分 自噬在ghrelin抗胰岛β细胞凋亡中的作用
•   一、研究背景
•   二、材料与方法
•   三、实验结果
•   四、讨论
•   五、结论
• 全文小结
• 创新和展望
• 参考文献
• 综述: Ghrelin对细胞生长的调节作用
•   参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 袁雪

导师: 刘红

关键词: 胰岛细胞,凋亡,高糖高脂,自噬,氯喹

来源: 广西医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 广西医科大学

基金: 国家自然科学基金地区项目(项目编号:81760154),国家自然科学基金青年科学基金项目(项目编号:31600677),广西自然科学基金面上项目(项目编号:2017JJA10168),大学生创新创业项目(项目编号:201710598006,201810598030)

分类号: R329.25

DOI: 10.27038/d.cnki.ggxyu.2019.000103

总页数: 102

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