犬β干扰素的表达及其抗细小病毒复制的研究

论文摘要

犬细小病毒（Canine Parvovirus,CPV）病作为危害犬类健康最严重的传染病之一,对犬类的健康和生存有着巨大的威胁。随着时间的变化CPV也在不断地发生变异,给此病的预防与治疗带来巨大挑战。干扰素（interferon,IFN）是一种广泛表达于脊椎动物体内的多功能细胞因子,并且具有一系列的生物活性如抗病毒、抗增殖、抗肿瘤及免疫调节作用。其中IFN-β是天然免疫和适应性免疫中的一个重要的中间诱导分子和效应分子,它对抗病毒机制的独特作用是IFN-α及其亚型无法代替和弥补。现有的动物干扰素主要采用原核表达的方法来制备,需要经过变性和复性的过程来获得具有活性的蛋白质,生产工艺复杂,大大限制了干扰素在兽医临床上的应用,而利用真核细胞表达的干扰素更接近天然干扰素的结构。相比大肠杆菌表达的犬IFN-α,CHO表达的干扰素具有良好的抗病毒活性和免疫原性,并且副作用更小。本研究从贵州大学动物医院采集犬血液,利用分离的外周血淋巴细胞中来提取总DNA,PCR扩增犬IFN-β基因,克隆并进行序列分析;构建犬IFN-β真核表达质粒,将其在CHO-K1细胞中表达,并研究其对CPV的抗病毒活性。本论文主要研究内容包括:1.犬IFN-β基因的扩增、克隆及序列分析根据GenBank登录的犬IFN-β基因序列（FJ194477）设计合成特异性引物,通过PCR从犬外周血淋巴细胞总DNA中扩增IFN-β基因CDS区并进行克隆测序。运用生物信息学方法对犬IFN-β基因进行序列分析,并对其理化性质以及编码蛋白质的二级结构、三级结构进行预测,构建分子系统进化树。结果显示:犬IFN-β基因编码区全长561 bp,共编码186个氨基酸,其分子式可表示为C1014H1593N263O290S9,分子质量为22.40 ku;属于亲水性蛋白,理论等电点为5.98;犬IFN-β含有丰富的二级结构,以α螺旋（76.88%）和无规卷曲（19.35%）为主,蛋白质三级结构呈弯曲螺旋结构;与貉、威德尔海豹、金钱豹、家猫、宽吻海豚、人、鸡和绿头鸭相对应序列核苷酸序列同源性分别为98.4%、87.2%、85.2%、84.7%、79%、74.9%、43.9%和43.3%。同源性及系统进化树分析结果表明犬与貉IFN-β核苷酸同源性最高（为98.4%）,亲缘关系最近。2.犬IFN-β基因重组真核表达载体的构建及其表达鉴定本研究主要构建犬IFN-β基因重组真核表达载体,对犬IFN-β在CHO-K1细胞中的表达进行鉴定。将上一步扩增得到的目的基因亚克隆至pEGPF-C1载体上,构建得到重组真核表达质粒pEGPF-C1-IFN-β,并通过PCR、酶切以及测序确认。利用脂质体将重组质粒转染CHO-K1细胞,转染后48 h收集细胞并提取总蛋白。Western-blotting结果显示,表达产物能与抗GFP标签鼠单克隆抗体特异性结合,在55ku处出现目的蛋白表达产物。本实验成功构建出犬IFN-β基因重组真核表达载体pEGPF-C1-IFN-β,并在CHO-K1细胞中成功表达。3.犬重组IFN-β对CPV复制的影响将F81细胞进行传代,设立四组实验组分别为阳性组、阴性对照组、空白对照组和控制对照组。阳性组加入1 mLCaIFN-β真核表达产物,预处理F81细胞5h,然后接种CPV。阴性对照组,加入空载体pEGFP-C1真核表达产物1 mL,预处理F81细胞5 h后接种CPV。空白对照组传代5 h后直接接种CPV,控制对照组均不加。通过光学显微镜观察细胞病变,四组接种后分别于12 h、24 h以及36 h收集细胞悬液,反复冻融3次后收集病毒,并提取DNA,进行CPV-VP2基因实时荧光定量PCR分析,观察三组在不同时间病毒量的变化。结果显示:相比阴性对照组,阳性组病毒复制得到一定程度的抑制,在24 h时最为明显,细胞病变程度较轻。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略词
• 文献综述
•   1 犬细小病毒病
•     1.1 犬细小病毒起源
•     1.2 犬细小病毒流行病学
•     1.3 CPV的传播与发病机制
•     1.4 临床症状
•     1.5 CPV的诊断与PVE的治疗
•       1.5.1 液体治疗
•       1.5.2 抗生素治疗
•       1.5.3 止吐治疗
•       1.5.4 营养支持
•       1.5.5 抗病毒治疗
•       1.5.6 疼痛管理
•     1.6 CPV的预防
•   2 干扰素的研究概况
•     2.1 IFN-β三级结构
•     2.2 IFN-β的动态构象
•     2.3 IFN-β的信号通路
•     2.4 IFN-β的功能
•       2.4.1 免疫调节功能
•       2.4.2 抗病毒功能
•       2.4.3 抗肿瘤功能
•       2.4.4 抗炎功能
•     2.5 IFN-β对疾病的治疗作用
•     2.6 干扰素的免疫原性
•     2.7 干扰素在宠物临床的应用
•   3 研究背景与目的意义
• 第一章 犬IFN-β基因的扩增、克隆及序列分析
•   1 材料
•     1.1 实验材料
•     1.2 试剂
•     1.3 主要仪器
•   2 方法
•     2.1 引物设计
•     2.2 犬淋巴细胞分离
•     2.3 犬淋巴细胞总DNA的提取
•       2.3.1 贴壁培养细胞处理
•       2.3.2 DNA的提取
•     2.4 犬IFN-β基因的PCR扩增
•       2.4.1 犬IFN-β基因的PCR扩增
•       2.4.2 琼脂糖凝胶电泳
•     2.5 目的基因的纯化
•     2.6 犬IFN-β基因的克隆
•       2.6.1 CaCl2 法制备感受态细胞DH5α
•       2.6.2 目的基因的连接
•       2.6.3 目的基因的转化
•       2.6.4 质粒的提取
•       2.6.5 重组质粒PCR和双酶切鉴定
•     2.7 犬IFN-β生物信息学分析
•   3 结果与分析
•     3.1 淋巴细胞提取
•     3.2 犬IFN-β基因的克隆
•     3.3 犬IFN-β生物信息学分析
•       3.3.1 犬IFN-β理化性质分析
•       3.3.2 犬IFN-β二级结构分析
•       3.3.3 犬IFN-β蛋白三级结构分析
•       3.3.4 犬IFN-β基因同源性分析
•       3.3.5 犬IFN-β基因的遗传进化分析
•   4 讨论
• 第二章 犬IFN-β基因重组真核表达载体的构建及其表达鉴定
•   1 材料
•     1.1 细胞、菌株及质粒
•     1.2 主要试剂
•     1.3 试验仪器
•   2 方法
•     2.1 引物的设计与合成引物
•     2.2 相关溶液的配置
•     2.3 重组表达载体pEGFP-C1-IFN-β的构建
•     2.4 CHO-K1 细胞的培养
•     2.5 重组质粒pEGFP-C1-IFN-β的转染
•     2.6 观察pEGFP-C1-IFN-β重组蛋白的表达情况
•     2.7 表达产物Western-blotting检测
•   3 结果与分析
•     3.1 重组质粒pEGFP-C1-IFN-β的构建与验证
•     3.2 重组质粒pEGFP-C1-IFN-β的在CHO-K1 细胞中的表达情况
•     3.3 表达产物Western-blotting检测
•   4 讨论
• 第三章 犬重组IFN-β对CPV复制的影响
•   1 材料
•     1.1 主要材料
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要耗材及仪器
•   2 方法
•     2.1 引物设计
•     2.2 相关溶液的配置
•     2.3 F81 细胞的培养
•     2.4 病毒TCID50 的测定
•     2.5 细胞总DNA的提取
•     2.6 标准质粒的制备
•     2.7 标准质粒拷贝数计算
•     2.8 反应体系的建立与条件优化
•     2.9 CPV-VP2 基因Taq Man荧光探针标准曲线的建立
•     2.10 重复性试验
•     2.11 样本的检测
•   3 结果与分析
•     3.1 反应体系的建立与条件优化结果
•     3.2 TaqMan荧光探针标准曲线的建立
•     3.3 CPV-VP2 基因DNA样本检测
•       3.3.1 F81 细胞CPE
•       3.3.2 重组CaIFN-β对CPV复制的影响
•   4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 发表文章

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄梦秋

导师: 嵇辛勤

关键词: 犬细小病毒,犬干扰素,真核表达,抗病毒

来源: 贵州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 贵州大学

基金: 贵州省科技厅条件平台项目(“贵州省实验动物质量监督检测中心”,黔科平台[2014]4005)

分类号: S852.65

总页数: 84

文件大小: 2493K

下载量: 95