一种含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物及其制备方法和应用论文和设计-郭占勇

全文摘要

本发明涉及食品及日化领域，具体是一种含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物及其制备方法和应用。含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物结构式如式（1）所示，本发明制备得到的含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物水溶性良好并具有很好的抗氧化活性，可应用于制备环境友好型抗氧化剂，且该反应高效、易于推广，所需设备及原料易得，可广泛应用于食品及日化领域，为高值化壳聚糖的应用开发奠定了基础。式（1）。

主设计要求

1.一种含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物，其特征在于：含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物结构式如式（1）所示，式（1）其中，R为噻唑基、噻二唑基、甲基噻二唑基或三氮唑基；n为平均聚合度，取值范围是10～1242。

设计方案

1.一种含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物，其特征在于：含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物结构式如式（1）所示，

设计说明书

技术领域

本发明涉及食品及日化领域，具体是一种含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

壳聚糖来源丰富，是自然界中发现的唯一天然阳离子多糖。壳聚糖具有优异的抗菌性、无毒性、成膜性、生物相容性和生物可降解性，因此，壳聚糖的应用受到了众多研究者的关注，并被广泛应用于农业、食品、医药等多个行业领域。尤其在食品领域，壳聚糖在可食性抗菌包装、防腐保鲜、乳化、增稠、果汁澄清、和功能性食品方面表现出良好的应用前景。但是由于壳聚糖分子内、分子间含有氨键，且分子链结构刚硬，使得壳聚糖材料结构致密、溶解性较差，仅能溶于酸性溶液，大大限制了壳聚糖在食品领域的进一步应用。通过对壳聚糖的化学修饰，引入功能性基团，可以得到水溶性和活性较好的衍生物，这对丰富壳聚糖的应用开发具有重要意义。

脲类化合物是一类极为重要的小分子有机化合物，自其被发现具有良好的生物活性来便受到各界人±的广泛关注，脲在化学、农业、医学等多种领域有重要用途。尤其在医药领域，脲类衍生物因具有良好的生物学特性，使其能够用作抗增殖、抗癌、抗惊厥、抗糖尿病、镇痛、抗艾滋病毒、抗真菌和抗菌等药物。但很少有研究报道脲类化合物的抗氧化活性，使其在食品领域的应用受到了限制。

发明内容

本发明目的是提供一种含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物，含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物结构式如式（1）所示，

式（1）

其中，R为噻唑基、噻二唑基、甲基噻二唑基或三氮唑基；n为平均聚合度，取值范围是10～1242。

一种含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物的制备方法：

1）将烟酰氯与叠氮化钠水溶液反应制得3-吡啶异氰酸酯，反应产物与氨基杂环反应制得小分子脲，待用；

2）将壳聚糖与氯甲酸甲酯反应制得N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖，反应产物与氨基杂环反应得到N<\/i>-杂环脲基壳聚糖，待用；

3）上述所得N<\/i>-杂环脲基壳聚糖与氯乙酰氯反应，反应产物再与步骤1）所得的小分子脲反应，经纯化即得到式（1）所示的含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物。

所述步骤1）将烟酰氯分散于过量的丙酮中获得分散液，再于冰浴条件下将分散液滴入叠氮化钠水溶液中，滴加在冰浴条件下搅拌直至溶液分层，将上层溶液在60-70℃下释放氮气，得3-吡啶异氰酸酯；将所得3-吡啶异氰酸酯与不同氨基杂环在60-70℃反应24-28h，然后抽滤、重结晶、冻干即可得到小分子脲；所述不同氨基杂环为2-氨基噻唑、2-氨基-1,3,4-噻二唑、2-氨基-5-甲基-1,3,4-噻二唑或3-氨基-1,2,4-三氮唑。

所述烟酰氯与叠氮化钠的摩尔比为1：（5～6），所述3-吡啶异氰酸酯与不同氨基杂环的摩尔比为1:1.5。

所述步骤2) 将壳聚糖溶解于过量水中并置于0℃冰浴条件下，温度低于10℃时加入甲醇，温度低于5℃时加入氯甲酸甲酯并搅拌反应6～7h，期间，反应体系温度保持在0℃-5℃，体系pH值保持在2～7，反应结束后用无水乙醇沉淀、过滤、洗涤后将滤饼冷冻干燥，得到 N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖；然后，取N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖溶解于含氯化锂的N,N<\/i>-二甲基乙酰胺溶液中，再加入氨基氮杂环在110-120℃条件下搅拌反应12～14 h，反应后用无水乙醇沉淀，经过滤、洗涤后将滤饼冷冻干燥，得到 N<\/i>-杂环脲基壳聚糖。

所述含氯化锂的N,N<\/i>-二甲基乙酰胺溶液中氯化锂的质量终浓度为8%；所述壳聚糖与氯甲酸甲酯的摩尔比为1：（6～8），所述N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖与氨基杂环的摩尔比为1：（6～8）。

所述制备N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖时采用三乙胺调节体系pH值保持在2～7。

所述步骤3）将上述步骤2）所得N<\/i>-杂环脲基壳聚糖与氯乙酰氯在室温条件下反应24-36 h，待反应后，加入步骤1）所得小分子脲，而后直接用丙酮沉淀，经纯化和冷冻干燥后得如式（1）所示的含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物；其中，所述氯乙酰氯的摩尔量为 N<\/i>-杂环脲基壳聚糖的1-2倍；小分子脲的摩尔量为氯乙酰化N<\/i>-杂环脲基壳聚糖的2-3倍。

一种含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物的应用，所述含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物用于制备抗氧化剂。

一种制备所述衍生物的中间化合物，化合物结构式如下：

其中，R为噻唑基、噻二唑基、甲基噻二唑基或三氮唑基；n为平均聚合度，取值范围是10～1242。

本发明所具有的优点：

本发明通过化学修饰将具有优良生物活性的脲接入到了可降解性的壳聚糖分子中，合成得到了具有二者优点的新型壳聚糖衍生物。并对得到的壳聚糖衍生物进行了抗氧化活性测定，结果表明，所得到的壳聚糖衍生物具有较好的抗氧化活性，并且为高值化壳聚糖在食品及日化领域的应用开发奠定了基础。

（1）与壳聚糖相比本发明化合物引入活性基团脲后提高了其水溶性和生物活性，且通过活性测试发现了壳聚糖衍生物的抗氧化活性与脲基团数量、氮原子数量之间的关系，即脲基团数量越多，抗氧化活性越好；脲基团上氮原子数量越多，吸电子能力越强，抗氧化活性越好。

（2）本发明制备所得式（1）所示的含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物，其生物活性得以提高，例如：抗氧化性，此类衍生物可作为食品抗氧化添加剂。

（3）在合成工艺上本合成方法有以下优点：本发明所需设备及原料易得、成本较低、易于推广，而且本产品产率较高，可达60%以上。本发明所得产品可广泛用于食品、医药、日化等领域。

附图说明

图1为本发明实施例提供的含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物的合成路线图。

图2壳聚糖的红外光谱图。

图3本发明实施例提供N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖的红外光谱图，从图3可知与壳聚糖原料相比，1600cm^{-1<\/sup>处氨基的吸收峰消失，1700cm-1<\/sup>处出现甲氧羰基的振动吸收峰，证明完成了N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖的合成。}

图4为本发明实施例提供N<\/i>-噻唑脲基壳聚糖的红外光谱图，由图4可见，甲氧羰基在1700cm^{-1<\/sup>左右处的峰消失，在1648cm-1<\/sup>处出现脲基尖锐的吸收峰，且在指纹区779cm-1<\/sup>左右处有氮杂环的振动吸收峰，由此可证明N-(4-吡啶脲基)-壳聚糖合成。}

图5为本发明实施例提供N<\/i>-噻二唑脲基壳聚糖的红外光谱图。

图6为本发明实施例提供N<\/i>-甲基噻二唑脲基壳聚糖的红外光谱图。

图7为本发明实施例提供N<\/i>-三氮唑脲基壳聚糖的红外光谱图。

图8为本发明实施例提供噻唑基二脲类壳聚糖的红外光谱图，由图8可见，壳聚糖衍生物2位上脲基在1634cm^{-1<\/sup>处的吸收峰依然还在，在1714cm-1<\/sup>处出现了小分子脲基团的特征吸收峰，此外，在1536cm-1<\/sup>、779cm-1<\/sup>处出现了吡啶环和噻唑环的特征吸收峰，由此可证明噻唑基二脲类壳聚糖合成。}

图9为本发明实施例提供噻二唑基二脲类壳聚糖的红外光谱图。

图10为本发明实施例提供甲基噻二唑基二脲类壳聚糖的红外光谱图。

图11为本发明实施例提供三氮唑基二脲类壳聚糖的红外光谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例以及附图，对本发明作进一步的阐述。但本发明并不局限于此，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1

如图1所示，含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物的合成路线，其中，平均聚合度n取值范围是10～1242。

本实施例按以上合成路线合成目标化合物含氮杂环二脲类壳聚糖衍生物。

1）噻唑脲的制备：取0.89g烟酰氯均匀分散于10mL丙酮中，冰浴条件下将其慢慢滴入叠氮化钠水溶液（1.30g叠氮化钠溶于6mL去离子水）中，滴加完毕后在冰浴条件下继续搅拌3h，搅拌结束后，溶液已经分层，用玻璃毛细管抽吸除去下部水层，然后将上层溶液慢慢加入温度保持在60℃的烧瓶中，直至不再放出氮气为止，然后冷却并抽滤，得到3-吡啶异氰酸酯；接下来将制得的3-吡啶异氰酸酯与0.75g 2-氨基噻唑在60℃反应28h，然后抽滤、重结晶、冻干即可得到噻唑脲。

2）N<\/i>-噻唑脲基壳聚糖的制备：取1g壳聚糖（参见图2，分子量是2000-200000）在室温条件下溶解于30mL蒸馏水中，然后置于冰浴条件下，当温度低于10℃时加入30mL甲醇，当温度低于5℃时加入3.36mL氯甲酸甲酯并搅拌反应7h，期间通过滴加三乙胺控制溶液的pH值为2～7，反应结束后用无水乙醇沉淀、过滤、洗涤后将滤饼冷冻干燥，得N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖（参见图3）；而后取1g N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖溶于20mL质量浓度为8%的氯化锂的N，N<\/i>-二甲基乙酰胺溶液中，而后加入2.75g的2-氨基噻唑，在110℃条件下搅拌反应14h，反应结束后直接用乙醇沉淀，经抽滤、洗涤、真空冷冻干燥后得N<\/i>-噻唑脲基壳聚糖（参见图4）。

3）噻唑基二脲类壳聚糖：将1 mmol N<\/i>-噻唑脲基壳聚糖及1 mmol氯乙酰氯溶于20mL DMSO（二甲基亚砜）中，在室温条件下搅拌24 h，反应结束后加入2 mmol小分子噻唑脲，70℃条件下反应24h,然后用丙酮沉淀，抽滤、洗涤、真空冷冻干燥,得式（1）所示的含噻唑基二脲类壳聚糖的目标产物（参见图8），其中，R为噻唑基，n = 10-1242。

实施例2

与实施例1不同之处在于：

1）噻二唑脲的制备：取0.89g烟酰氯均匀分散于10mL丙酮中，冰浴条件下将其慢慢滴入叠氮化钠水溶液（1.63g叠氮化钠溶于6mL去离子水）中，滴加完毕后在冰浴条件下继续搅拌3h，搅拌结束后，溶液已经分层，用玻璃毛细管抽吸除去下部水层，然后将上层溶液慢慢加入温度保持在70℃的烧瓶中，直至不再放出氮气为止，然后冷却并抽滤，得到3-吡啶异氰酸酯；接下来将制得的3-吡啶异氰酸酯与0.76g 2-氨基-1,3,4-噻二唑在70℃反应24h，然后抽滤、重结晶、冻干即可得到噻二唑脲。

2）N<\/i>-噻二唑脲基壳聚糖的制备：取1g壳聚糖（分子量是2000-200000）在室温条件下溶解于30mL蒸馏水中，然后置于冰浴条件下，当温度低于10℃时加入35mL甲醇，当温度低于5℃时加入3.82mL氯甲酸甲酯并搅拌反应6h，期间通过滴加三乙胺控制溶液的pH值为2～7，反应结束后用无水乙醇沉淀、过滤、洗涤后将滤饼冷冻干燥，得N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖（参见图3）；而后取1g N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖溶于20mL质量浓度为8%的氯化锂的N，N<\/i>-二甲基乙酰胺溶液中，而后加入3.70g的2-氨基-1,3,4-噻二唑，在110℃条件下搅拌反应12h，反应结束后直接用乙醇沉淀，经抽滤、洗涤、真空冷冻干燥后得N<\/i>-噻二唑脲基壳聚糖（参见图5）。

3）噻二唑基二脲类壳聚糖：将1 mmol N<\/i>-噻二唑脲基壳聚糖及2 mmol氯乙酰氯溶于20 mL DMSO（二甲基亚砜）中，在室温条件下搅拌28 h，反应结束后加入3 mmol小分子噻二唑脲，60℃条件下反应24h,然后用丙酮沉淀，抽滤、洗涤、真空冷冻干燥,得式（1）所示的含噻二唑基二脲类壳聚糖的目标产物（参见图9），其中，R为噻二唑基，n = 10-1242。

实施例3

与实施例1不同之处在于：

1）甲基噻二唑脲的制备：取0.89g烟酰氯均匀分散于10mL丙酮中，冰浴条件下将其慢慢滴入叠氮化钠水溶液（1.79g叠氮化钠溶于6mL去离子水）中，滴加完毕后在冰浴条件下继续搅拌3h，搅拌结束后，溶液已经分层，用玻璃毛细管抽吸除去下部水层，然后将上层溶液慢慢加入温度保持在60℃的烧瓶中，直至不再放出氮气为止，然后冷却并抽滤，得到3-吡啶异氰酸酯；接下来将制得的3-吡啶异氰酸酯与0.86g 2-氨基-5-甲基-1,3,4-噻二唑在60℃反应28h，然后抽滤、重结晶、冻干即可得到甲基噻二唑脲。

2）N<\/i>-甲基噻二唑脲基壳聚糖的制备：取1g壳聚糖（分子量是2000-200000）在室温条件下溶解于30mL蒸馏水中，然后置于冰浴条件下，当温度低于10℃时加入30mL甲醇，当温度低于5℃时加入3.36mL氯甲酸甲酯并搅拌反应7h，期间通过滴加三乙胺控制溶液的pH值为2～7，反应结束后用无水乙醇沉淀、过滤、洗涤后将滤饼冷冻干燥，得N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖（参见图3）；而后取1g N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖溶于20mL质量浓度为8%的氯化锂的N，N<\/i>-二甲基乙酰胺溶液中，而后加入3.16g的2-氨基-5-甲基-1,3,4-噻二唑，在110℃条件下搅拌反应14h，反应结束后直接用乙醇沉淀，经抽滤、洗涤、真空冷冻干燥后得N<\/i>-甲基噻二唑脲基壳聚糖（参见图6）。

3）甲基噻二唑基二脲类壳聚糖：将1 mmol N<\/i>-甲基噻二唑脲基壳聚糖及1 mmol氯乙酰氯溶于20 mL DMSO（二甲基亚砜）中，在室温条件下搅拌32 h，反应结束后加入2 mmol小分子甲基噻二唑脲，70℃条件下反应24h,然后用丙酮沉淀，抽滤、洗涤、真空冷冻干燥,得式（1）所示的含甲基噻二唑基二脲类壳聚糖的目标产物（参见图10），其中，R为甲基噻二唑基，n = 10-1242。

实施例4

与实施例1不同之处在于：

1）三氮唑脲的制备：取0.89g烟酰氯均匀分散于10mL丙酮中，冰浴条件下将其慢慢滴入叠氮化钠水溶液（1.95g叠氮化钠溶于6mL去离子水）中，滴加完毕后在冰浴条件下继续搅拌3h，搅拌结束后，溶液已经分层，用玻璃毛细管抽吸除去下部水层，然后将上层溶液慢慢加入温度保持在70℃的烧瓶中，直至不再放出氮气为止，然后冷却并抽滤，得到3-吡啶异氰酸酯；接下来将制得的3-吡啶异氰酸酯与0.63g 3-氨基-1,2,4-三氮唑在70℃反应24h，然后抽滤、重结晶、冻干即可得到三氮唑脲。

2）N<\/i>-三氮唑脲基壳聚糖的制备：取1g壳聚糖（分子量是2000-200000）在室温条件下溶解于30mL蒸馏水中，然后置于冰浴条件下，当温度低于10℃时加入35mL甲醇，当温度低于5℃时加入3.82mL氯甲酸甲酯并搅拌反应6h，期间通过滴加三乙胺控制溶液的pH值为2～7，反应结束后用无水乙醇沉淀、过滤、洗涤后将滤饼冷冻干燥，得N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖（参见图3）；而后取1g N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖溶于20mL质量浓度为8%的氯化锂的N，N<\/i>-二甲基乙酰胺溶液中，而后加入3.08g的3-氨基-1,2,4-三氮唑，在110℃条件下搅拌反应12h，反应结束后直接用乙醇沉淀，经抽滤、洗涤、真空冷冻干燥后得N<\/i>-三氮唑脲基壳聚糖（参见图7）。

3）三氮唑基二脲类壳聚糖：将1 mmol N<\/i>-三氮唑脲基壳聚糖及2 mmol氯乙酰氯溶于20 mL DMSO（二甲基亚砜）中，在室温条件下搅拌36 h，反应结束后加入3 mmol小分子三氮唑脲，60℃条件下反应24h,然后用丙酮沉淀，抽滤、洗涤、真空冷冻干燥,得式（1）所示的含三氮唑基二脲类壳聚糖的目标产物（参见图11），其中，R为三氮唑基，n = 10-1242。

应用例

抗氧化活性测定

（1）清除超氧阴离子抗氧化能力的测定：分别测定实施例1～4中壳聚糖、制备的N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖、N<\/i>-杂环脲基壳聚糖和含杂环基二脲类壳聚糖的清除超氧阴离子能力并做对比(表1)，具体为：

将壳聚糖、N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖、N<\/i>-噻唑脲基壳聚糖、N<\/i>-噻二唑脲基壳聚糖、N<\/i>-甲基噻二唑脲基壳聚糖、N<\/i>-三氮唑脲基壳聚糖、噻唑基二脲类壳聚糖、噻二唑基二脲类壳聚糖、甲基噻二唑基二脲类壳聚糖和三氮唑基二脲类壳聚糖真空冷冻干燥至恒重后，将上述恒重后样品分别用三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液配制浓度为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mg\/mL的溶液。取1.5 mL不同浓度的样品溶液，依次加入1.5mL三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、0.5mL还原性辅酶Ⅰ(468μM)，0.5mL硝基四氮唑蓝（300μM）和0.5mL吩嗪硫酸甲酯(60μM)，在试管中混匀后，各试管内样品的最终浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg\/mL，室温下静置5min，在560nm处测定吸光度A，对照组0.5mL三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液代替还原性辅酶Ⅰ，空白组1.5mL三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液代替样品溶液，样品均测三次，取平均值，计算清除超氧阴离子能力。

清除超氧阴离子能力(％)＝[1-(A样品-A对照)\/A空白]×100。结果如表1所示。

表1，壳聚糖、N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖、N<\/i>-杂环脲基壳聚糖和含杂环基二脲类壳聚糖的清除超氧阴离子能力（%）

（2）清除羟基自由基抗氧化能力的测定：分别测定实施例1～4中壳聚糖、制备的N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖、N<\/i>-杂环脲基壳聚糖和含杂环基二脲类壳聚糖的清除羟基自由基能力并做对比(表2)，具体为：

将壳聚糖、N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖、N<\/i>-噻唑脲基壳聚糖、N<\/i>-噻二唑脲基壳聚糖、N<\/i>-甲基噻二唑脲基壳聚糖、N<\/i>-三氮唑脲基壳聚糖、噻唑基二脲类壳聚糖、噻二唑基二脲类壳聚糖、甲基噻二唑基二脲类壳聚糖和三氮唑基二脲类壳聚糖真空冷冻干燥至恒重后，各准确称量60mg，加入6mL 去离子水溶解，配制成浓度为10mg\/mL 的样品母液。羟自由基清除实验：分别量取 11.3、22.5、45、90、180μL的样品母液于试管中，加水至1mL。然后依次加入0.5mLEDTA-Fe溶液、1mL磷酸缓冲液、1mL番红花红T溶液以及1mL过氧化氢溶液。样品溶液的终浓度分别为0.025mg\/mL、0.05mg\/mL、0.1mg\/mL、0.2mg\/mL、0.4mg\/mL。同时，用1mL去离子水代替样品作为空白组，用1mL去离子水和1mL磷酸缓冲液代替样品和过氧化氢溶液作为对照组。反应体系加塞摇晃均匀后，于37℃水浴中反应30min。反应结束后，放入冰水中淬灭反应，在520nm波长处测试记录4.5mL反应液的吸光度，样品均测三次，取平均值，计算清除羟自由基能力。

清除羟自由基能力(％)＝(A样品-A空白)\/(A对照-A空白)×100。结果如表2所示。

表2，壳聚糖、N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖、N<\/i>-杂环脲基壳聚糖和含杂环基二脲类壳聚糖的清除羟自由基能力（%）

实验结果：本发明合成衍生物所采用的原料壳聚糖、N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖、N<\/i>-噻唑脲基壳聚糖、N<\/i>-噻二唑脲基壳聚糖、N<\/i>-甲基噻二唑脲基壳聚糖、N<\/i>-三氮唑脲基壳聚糖，以及合成的衍生物噻唑基二脲类壳聚糖、噻二唑基二脲类壳聚糖、甲基噻二唑基二脲类壳聚糖和三氮唑基二脲类壳聚糖清除超氧阴离子能力如表1所示，清除羟自由基能力如表2所示，本发明所合成的含脲类壳聚糖衍生物的清除能力明显优于N<\/i>-甲氧羰基壳聚糖和壳聚糖原料，且表现出一定的抗氧化规律，即：含杂环基二脲类壳聚糖的抗氧化活性要强于N<\/i>-杂环脲基壳聚糖，这说明脲基团的引入能明显提高壳聚糖衍生物的抗氧化活性，且脲基团数量越多，抗氧化活性越好；此外，几种终产物二脲类壳聚糖抗氧化活性由高到低为含三氮唑基二脲类壳聚糖>含甲基噻二唑基二脲类壳聚糖>含噻二唑基二脲类壳聚糖>含噻唑基二脲类壳聚糖，这说明小分子脲基团上氮原子数量越多，吸电子能力越强，抗氧化活性越好。

设计图