摘要：阿尔茨海默病（AD）的病理特征之一是β-淀粉样肽（Aβ）在脑区的积聚，这些脑区主要是胆碱能神经元集聚区，造成胆碱能神经元的凋亡丢失，引起记忆和认知障碍。这一实验的目的是观察Aβ1-42 对大鼠胆碱能神经元钾通道的影响。全细胞膜片钳电压钳模式记录，在酶解分离的基底前脑神经元上进行，结果显示当钳制电压在-30 和30 mV 范围时，Aβ1-42（10 nM）可抑制全细胞外向钾电流，使用胰淀素受体竞争性拮抗剂AC253（10 nM），可以阻断Aβ1-42 的作用，这表明Aβ1-42 对中枢神经元细胞膜钾离子通透性的影响，是通过胰淀素受体介导的。
关键词：神经元；膜片钳；钾通道；胰淀素受体
0 引言
大脑的基底前脑区是一个在学习和记忆过程中起着重要作用的区域。经测定在这一结构区域的神经元是胆碱能神经元。阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）的主要神经病理学特征，既是基底前脑胆碱能神经元的丢失和神经炎症性β-淀粉样肽（Aβ）斑块沉积。Aβ 由39-43 个氨基酸组成，是AD 疾病病人脑中老年斑的主要成分。人胰淀素是一种淀粉样肽，最早从糖尿病患者的胰岛中分离出来，是胰淀素受体的内源性配体。胰淀素受体的激活对维护细胞的兴奋性和葡萄糖在体内的稳态起着重要作用[1]。在这项研究中，通过检查Aβ1-42 对急性分离的大鼠基底前脑神经元钾通道的影响，来了解阿尔茨海默病的发病机理和探索新的药物作用靶点。
1 材料与方法
在电生理记录中使用的所有化学药品均购自Sigma 公司。Aβ1-42 和AC253 溶解在去离子水中保存于-70℃冰箱内。所用SD 大鼠购置于河南省实验动物中心,被安放在22℃的饲养室内，并给予12：12 h 光照昼夜循环。
1.1脑神经元分离手术过程
雄性SD 大鼠（出生后20-25 天）麻醉后，被迅速断头取出脑组织，放在冰冷的人工脑脊液中，人工脑脊液内含有氯化钠140 mM，氯化钾2.5 mM，氯化钙1.5mM，氯化镁1.2 mM，HEPES10 mM 和D - 葡萄糖33 mM（pH 值7.4）。用震动切片机（VT 1000S，德国），将基底前脑区脑组织切成350μM 厚脑片，然后用0.02% 的胰蛋白酶液处理脑片（25 min），温度控制在30℃。用机械性吹打的方法进行急性分离神经元的制备，将脑片分散成单个细胞，接种于多聚L- 赖氨酸涂层的盖玻片上，放在倒置显微镜下观察和进行电生理记录[2]。在整个分离过程中，细胞要连续供给氧气。
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1.2电生理记录
全细胞膜片钳记录在室温（20-22 ℃）下进行，实验数据被用Axopatch-700B 放大器和Digidata1440A 数据采集系统（Axon 仪器）采集。记录电极用1.5mm 直径薄壁玻璃（世界精密仪器公司），经微电极拉制仪（PC-10，Narishige 科学仪器实验室，日本）制成，其电极阻抗约3-6 ΩM。电极管内液成分含K-methylsulfate 140 mM，EGTA 10 mM，氯化镁5 mM，氯化钙1 mM，HEPES10 mM, 钠-ATP 2.2 mM 和钠-GTP 0.3 mM（pH 值7.2）。所有记录细胞均被用人工脑脊液以大约1 毫升/ 分钟流速进行连续灌注，记录使用低通滤波2 kHz，高通滤波10 kHz。采集得到数据储存至计算机，用pCLAMP10.0 软件进行分析。
1.3统计分析
实验结果表示为平均值±S.E.M。采用方差分析和LSD-t 检验进行统计数据比较。P 值小于0.05 被认为具有显著性差异。
2 结果
记录的30 个细胞，为了测量细胞的最大电流活动，当全细胞记录模式建立后，所有细胞的膜电位被钳制在-80 mV，接近细胞膜的静息膜电位水平；然后，给予指令电位刺激从-110 mV 到+30 mV（20 mV/s 的步距），观察诱发细胞膜的通道电流。当指令电位在+30 mV 时，对照组细胞外向钾电流的幅度为6.2±0.1 nA(n=15)；在细胞外灌流液中加入Aβ1-42（10 nM），记录到的外向钾电流的幅度为4.1±0.2 nA，Aβ1-42 显著抑制全细胞的外向钾电流，外向钾电流的幅度降低了38.5±2.5 %（n=15，P＜0.01）。另一组细胞当指令电位在+30 mV 时，其细胞外向电流的幅度为5.9±0.1 nA(n=15)，在细胞外灌流液中加入Aβ1-42（10 nM）同时，也加入胰淀素受体竞争性拮抗剂AC253（10 nM）其外向电流的幅度为5.8±0.2 nA，与对照组比较没有显著性差异（P=0.15），说明AC253 阻断了Aβ1-42 对DBB 神经元外向钾电流的抑制作用。
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3 讨论
越来越多的证据表明，钾通道在阿尔茨海默病中起重要作用。因为在中枢神经系统细胞中，钾通道是膜兴奋性、静息膜电位和自发放电率、动作电位波形和持续时间、神经递质释放和细胞凋亡的关键调控因子[3]。细胞膜对钾离子通透性是维持细胞膜静息电位平衡的重要基础，Aβ1-42 抑制膜内钾离子的外流，使细胞内带正电荷离子增加，静息电位负值减小，细胞膜发生去极化，很容易达到阈电位，产生动作电位，使细胞的兴奋性增加，触发神经元的凋亡过程，这是β-淀粉样肽产生神经毒性的机制之一，另外，Aβ 可以诱发DNA 的损伤[4]。AC253 阻断Aβ1-42 的作用，表明Aβ1-42 影响胆碱能神经元兴奋性是通过胰淀素受体介导的。这对于阐明阿尔茨海默氏病的发病机制并寻找新的药物治疗作用靶点非常重要。
参考文献
[1]Li Zongming, Li Xiufeng. Functional coupling reactions of human amylin receptor and nicotinic acetylcholine receptors in rat brain neurons[J].Acta Physiologica Scinica,2012,64(1):69-74.
[2]李秀凤,李宗明.人胰淀素和烟碱诱导相同通道的激活[J].郑州大学学报(医学版),2016,51(2):194-196.
[3]Ciccone Roselia, Piccialli Ilaria, Grieco Paolo, et al. Synthesis and Pharmacological Evaluation of a Novel Peptide Based on Anemonia sulcata BDS-I Toxin as a New KV3.4 Inhibitor Exerting a Neuroprotective Effect Against Amyloid-β Peptide[J]. Frontiers in chemistry,2019,7:1-11.
[4]Castillo WO, Aristizabal-Pachon AF.Galantamine protects against beta amyloid peptide- induced DNA damage in a model for Alzheimer’s disease[J].Neural Regen Res,2017,12(6):916-917.
中图分类号：R338
文献标识码：B
DOI:10.19613/j.cnki.1671-3141.2019.86.162
本文引用格式：李宗明,李秀凤.β-淀粉样肽(Ab)对胆碱能神经元钾通道的影响[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(86):264.
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