灰茶尺蠖EgSCP2多克隆抗体制备及组织表达分析

论文摘要

【目的】制备灰茶尺蠖（Ectropis grisescens Warren）固醇转运蛋白（SCP）的多克隆抗体,并检测灰茶尺蠖SCP2蛋白在灰茶尺蠖不同组织中的表达情况,为进一步研究SCP2对胆固醇的转运和利用机制以及其生物学功能奠定基础。【方法】以灰茶尺蠖5龄1 d幼虫中肠cDNA为模板,应用PCR技术扩增得到EgSCP2片段,将EgSCP2目的片段连入pMD18-T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的分子质量。以测序正确的EgSCP2基因片段为模板,扩增EgSCP2的开放阅读框,通过BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶连接到原核表达载体pET32a中,并转化大肠杆菌BL21 （DE3）进行原核表达,离心收集并超声波破碎菌体,取上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE检测,在不同温度、不同IPTG终浓度条件下优化EgSCP2重组蛋白表达条件。经Ni-NTA树脂层析柱纯化得到EgSCP2重组蛋白。将该蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗EgSCP2血清抗体,采用间接ELISA方法测定了该血清抗体的效价,并通过Western blotting检测EgSCPx和EgSCP2蛋白在灰茶尺蠖不同组织中的表达情况。【结果】扩增得到EgSCP2基因开放阅读框（ORF）全长为441 bp,编码146个氨基酸,预测编码蛋白的分子质量为16 ku。优化蛋白诱导条件的试验表明,28℃、IPTG浓度为1.0 mmol/L时,EgSCP2重组蛋白表达量最高,该条件下通过大肠杆菌表达的EgSCP2重组蛋白分子质量约为34 ku,其大小与预期结果一致,且其在上清液和沉淀中均有表达。间接ELISA法检测结果表明,制备的兔抗EgSCP2抗体具有较好的灵敏度,效价达到1∶256 000。Western blotting检测结果显示,58 ku EgSCPx在5龄2 d灰茶尺蠖的表皮、脂肪体和中肠均有表达,且在中肠的表达量远高于表皮和脂肪体;16 ku EgSCP2仅在表皮和脂肪体中表达。58 ku EgSCPx蛋白在4龄和5龄灰茶尺蠖的幼虫中肠大量表达,在蛹期少量表达,在成虫期几乎不表达。【结论】纯化获得了EgSCP2重组蛋白,其最优表达条件为温度28℃、IPTG终浓度1.0 mmol/L;制备了高效价的灰茶尺蠖EgSCP2多克隆抗体,明确了灰茶尺蠖EgSCPx蛋白在不同组织中的表达规律。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 供试材料
•   1.2 试验方法
•     1.2.1 EgSCP2表达引物的设计及序列扩增
•     1.2.2 EgSCP2原核表达载体的构建与鉴定
•     1.2.3 EgSCP2重组蛋白的可溶性诱导表达及纯化
•     1.2.4 EgSCP2重组蛋白多克隆抗体的制备
•     1.2.5 EgSCP2蛋白的多克隆抗体效价测定
•     1.2.6 EgSCPx和EgSCP2蛋白在不同组织中的表达情况
• 2 结果与分析
•   2.1 灰茶尺蠖EgSCPx和EgSCP2基因的扩增
•   2.2 灰茶尺蠖EgSCP2原核表达载体的构建
•   2.3 灰茶尺蠖EgSCP2重组蛋白的表达、纯化与鉴定
•   2.4 灰茶尺蠖EgSCP2重组蛋白多克隆抗体效价的测定
•   2.5 灰茶尺蠖EgSCPx和EgSCP2蛋白在不同组织中的表达情况
• 3 讨 论
• 4 结 论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 张丽丽,武怡琼,魏佳平,刘梦丽,薛竞帆,靳爽,王玲,乔利

关键词: 灰茶尺蠖,固醇转运蛋白,原核表达,抗体制备,组织表达

来源: 西北农林科技大学学报(自然科学版) 2019年11期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 信阳师范学院生命科学学院/大别山农业生物资源保护与利用研究院,信阳农林学院

基金: 国家自然科学基金项目(31501902),河南省科技攻关计划项目(182102110034),信阳师范学院“南湖学者奖励计划”青年项目(2016058),信阳师范学院大学生科研基金项目(2017-DXS-141),国家重点研发计划“化学肥料和农药减施增效综合技术研发”试点专项(2016YFD0200900)

分类号: Q78

DOI: 10.13207/j.cnki.jnwafu.2019.11.014

页码: 114-122

总页数: 9

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