导读:本文包含了二烯丙基二硫醚论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:RORα,二烯丙基二硫,人胃癌MGC803细胞,增殖
二烯丙基二硫醚论文文献综述
苏坚,夏红,曾颖,苏波,刘芳[1]（2019）在《RORα高表达对二烯丙基二硫抑制人胃癌细胞增殖与迁移侵袭的影响》一文中研究指出目的观察高表达RORα对二烯丙基二硫(DADS)抑制人胃癌MGC803细胞增殖、迁移与侵袭的影响。方法集落形成实验与流式细胞术检测细胞增殖与细胞周期;细胞划痕和Transwell实验分别检测细胞迁移与侵袭。RT-PCR与Western blot分别检测RORα、MMP-9和TIMP3 mRNA与蛋白表达水平。结果 RT-PCR与Western blot检测显示,RORα高表达与DADS处理较对照组与空载体组RORαmRNA与蛋白表达明显上调,DADS+RORα高表达组上调更为显著(P<0.05)。与对照组和空载体组比较,RORα高表达与DADS处理组MMP-9表达下调,TIMP3表达上调,DADS+RORα高表达组改变最为显著。集落形成实验显示,RORα高表达与DADS处理组较对照组与空载体组的集落形成率明显降低。流式细胞术显示,与对照组和空载体组比较,RORα高表达与DADS处理组G2/M期细胞比率明显升高。细胞划痕和Transwell实验显示,RORα高表达与DADS处理组细胞迁移与侵袭能力明显降低。结论 RORα高表达可通过上调TIMP3与下调MMP-9促进DADS阻滞MGC803细胞G2/M期和抑制增殖与迁移侵袭。(本文来源于《中国组织化学与细胞化学杂志》期刊2019年03期）
赵宁[2]（2019）在《二烯丙基二硫（DADS）对脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞M1型活化的影响及其分子机制》一文中研究指出研究目的肝脏是酒精进入人体后主要的代谢场所,也是其毒害的首要靶器官,长期大量饮酒会导致酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)。疾病初期通常表现为可逆性的酒精性脂肪肝,若不加以控制和干预,可进一步发展成酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。严重酗酒时甚至可诱发广泛的肝细胞坏死,进而发展为肝衰竭和肝癌(hepatocellular carcinoma)。ALD是一种涉及多种发病机制的多因素疾病,目前并没有有效的药物治疗措施。现阶段对于ALD的发病机制已经有了多种研究和假设,其中乙醇暴露引起肝脏内枯否细胞活化和肝脏内氧化应激,已经被证实在ALD的发病过程中起到要作用。枯否细胞(Kupffer cells,KCs)是肝脏内的常驻巨噬细胞,在多种肝脏疾病的发生发展中都起到不可忽视的作用。乙醇暴露引起肠源性内毒素大量进入肝脏,导致肝脏KCs发生Ml型活化,可以释放大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-a(Tumor necrosis factor,TNF-a)等,对肝脏造成损伤。此外,过量乙醇在肝脏中代谢时,在细胞色素P450 2E1(Cytochrome P450 2E1,CYP2E1)和NADPH氧化酶(NADPH oxidative enzymes,NOX)的作用下,也可以生成大量活性氧和活性氮,造成肝脏氧化应激损伤。核转录因子E2相关因子2(Nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)是机体调节氧化应激的重要靶点,可以调控肝脏中解毒和抗氧化防御相关基因的表达。Nrf2可以通过促进多种Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达来诱导机体内源性的抗氧化防御,是目前发现的促进细胞抗氧化防御最重要的途径之一。通过激活Nrf2信号通路来保护包括乙醇在内的各种化学物质引起的肝损伤已经成为预防肝脏疾病的新策略。大蒜油(Garlic oil,GO)是一种通过蒸汽蒸馏制取的大蒜产品,具有许多有益的生物学活性。实验证明,大蒜具有多种药理作用,其中包括抗氧化、抗炎、抗癌、免疫调节、降低血压和控制血糖,以及对各种外源化学物引起的肝损伤具有一定的保护作用。研究发现GO可以有效的抑制乙醇诱导的氧化应激,其含有五种主要的有机硫化物(Organosulfur compounds,OSCs),这些OSCs也被发现可以引起HepG2细胞中Nrf2/HO-1途径的活化。那么GO中的有机硫化物是否能够减轻枯否细胞Ml型极化后造成的炎性因子分泌和氧化应激?发挥主要作用的成分是哪一种?其机制是否与Nrf2信号通路有关?这些都是尚未明确的问题。本实验拟通过LPS刺激RAW264.7细胞,建立KCs发生M1型活化的模型,利用酶联免疫吸附法(ELISA)和活性氧试剂盒对GO含有的五种有机硫化物中能够有效减轻KCs活化后引起的氧化应激和致炎因子大量分泌的有效成分进行筛选。同时,利用免疫印迹法(Western Blotting)和qRT-PCR法对Nrf2-Keapl信号通路相关蛋白及mRNA的含量进行检测,观察其能否引起Nrf2-Keapl信号通路的变化,探讨其在预防ALD发病中的可能作用,为ALD的防治提供新的思路和策略。研究方法1.采用CCK-8法检测大蒜油中五种主要有机硫化物对于RAW264.7细胞的细胞毒性,在安全剂量范围内选择高中低叁种剂量作为给药剂量。2.将RAW264.7细胞分为对照组、LPS组和不同剂量有机硫化物干预组。对照组不作任何处理,LPS组用1 μg/mL LPS诱导RAW264.7细胞活化;干预组先用不同浓度的有机硫化物孵育2 h,然后再加入1 μg/mL的LPS共同培养24h。24h后收集细胞上清液,用ELISA法检测细胞培养上清中炎性细胞因子包括TNF-a、IL-1β、IL-10等的水平,Griess Reagent法检测细胞上清液中NO浓度。根据上述结果筛选能够有效抑制LPS诱导后RAW264.7细胞分泌炎性细胞因子和一氧化氮的有机硫化物。3.筛选出DADS作为主要研究对象,以100μM DADS作为给药剂量,分别在DADS处理0h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h时提取细胞总蛋白和总RNA;Western Blotting法和qRT-PCR法检测 Nrf2、keap-1、NQO-1、SOD、ΥΥ-GCSc、HO-1、LC3、p62在不同时间段的蛋白和mRNA的表达水平。4.分别以0μM、2.5 μM、5 μM、12.5 μM、25 μM、500μM、100μMDADS处理RAW264.7细胞,24 h后提取细胞总蛋白和总RNA;Western Blotting法和qRT-PCR法检测在不同剂量DADS干预下Nrf2、keap-1、NQO-1、SOD、Υ-GCSc、HO-1、LC3、p62的蛋白和mRNA的表达水平。5.将RAW264.7细胞分为对照组、LPS组和LPS+(高/中/低)DADS组。对照组不作任何处理,LPS组用1 μg/mL LPS诱导,另外3组加入不同浓度DADS使浓度分别为25 μM、50 μM和100 μM,培养2 h后再用1 μg/mL LPS诱导。24h后提取细胞总蛋白和总RNA,Western Blotting法和qRT-PCR法检测Nrf2、keap-1、NQO-1、SOD、y-GCSc、HO-1、LC3、p62的蛋白和mRNA的表达水平；;制备细胞爬片,免疫荧光法检测细胞中Nrf2蛋白的变化情况;荧光探针孵育后收集细胞混悬液检测细胞中活性氧ROS的含量。6.将RAW264.7细胞分为5个对照组和5个DADS处理组,对照组不做任何处理,DADS组以100μM DADS处理24 h。然后两组中分别加入50 μM的放线菌酮处理0 min、15 min、30 min、45 min、60 min后提取细胞总蛋白,Western Blotting检测DADS干预对于Nrf2蛋白的降解速度是否有影响。研究结果1.五种有机硫化物的安全剂量:各剂量组的RAW264.7细胞活力在90%以上(P＞0.05)时视为细胞活性未受到明显影响,即为该种有机硫化物的安全剂量范围。DATS安全剂量范围为0～25μM;DADS安全剂量范围为0～150 μM;DAS安全剂量范围为0～1600μM;AMTS安全剂量范围为0～100 μM;AMDS安全剂量范围为0～200 μM。本实验浓度下的DATS/DADS/DAS/AMTS/AMDS对细胞均无明显毒性。2.五种有机硫化物对LPS诱导RAW264.7细胞分泌的炎性因子的影响:LPS组细胞上清液中炎性因子的水平均高于对照组(P<0.05);DATS/DADS+LPS组细胞上清液中NO、TNF-a、IL-1p的浓度较LPS组明显降低(均P<0.05),并呈剂量依赖性;DAS+LPS组细胞上清液中只有IL-lβ的含量有所下降(P<0.05);AMTS+LPS组细胞上清液中NO和TNF-αa的含量有所下降(P<0.05);AMDS+LPS组的细胞上清液中仅NO的含量有所下降(P<0.05)。3.不同时间、不同剂量DADS干预对RAW264.7细胞内Nrf2信号通路相关分子蛋白和mRNA水平的影响:与对照组相比,Nrf2蛋白表达量在DADS处理3 h、6 h、12 h和24 h时间点均明显升高(P<0.05),并且随着DADS干预剂量的增加呈现升高趋势(P<0.05);keap-1蛋白表达量在DADS处理3 h、6 h、12 h、24 h和48 h时间点均明显降低(P<0.05),并且随着DADS干预剂量的增加呈现降低趋势(P<0.05);NQO-1、HO-1和Υ-GCSc的蛋白表达量在DADS处理3h、6h、12 h、24 h和48h时间点均明显升高(P<0.05),并且随着DADS干预剂量的增加呈现升高趋势(P<0.05);SOD的蛋白表达量在不同剂量的DADS处理任何时间点与对照组相比均无明显差异(P>0.05)。qRT-PCR测定结果表明,与对照组相比,Nrf2的mRNA含量在DADS处理3 h、6 h、12 h和24 h时间点均明显降低(P<0.05),在不同剂量DADS处理后也明显降低(P<0.05);keap-1的mRNA含量在DADS处理3 h、6 h、12 h和24 h时间点均明显降低(PP<0.05),在不同剂量的DADS处理后也明显降低(P<0.05);NQO-1、HO-1、GCLm和GCLc的mRNA含量在DADS处理3h、6h、12 h和24 h时间点均明显升高(P<0.05),在不同剂量的DADS处理后也明显升高(P<0.05)。但是SOD的mRNA含量在不同剂量的DADS处理任何时间点与对照组相比均无明显差异(P＞0.05)。4.不同剂量DADS干预对LPS诱导后RAW264.7细胞内Nrf2信号通路相关分子蛋白和mRNA含量的影响:Western blotting和qRT-PCR测定结果表明,与对照组相比,LPS组中Nrf2和Keap-1的蛋白表达水平都显着降低(P<0.05),两种蛋白的mRNA含量也显着降低(P<0.05);与LPS组相比,DADS(低/中/高)+LPS组中Nrf2的蛋白表达量表现为上升趋势(P<0.05),keap-1的蛋白表达量相比LPS组则有所下降(P<0.05),但是两种蛋白的mRNA含量与LPS组相比均没有显着差异(P>0.05);与对照组相比,LPS组的NQO-1 和Υ-GCSc的蛋白表达量均显着降低(P<0.05),但LPS组的HO-1蛋白表达量与对照组相比明显增加(P<0.05),LPS组SOD蛋白的表达量与对照组相比无统计学差异(P>0.05);与对照组相比,LPS组的NQO-1、HO-1、SOD和GCLm的mRNA含量均有显着升高(P<0.05),但LPS组GCLc的mRNA含量与对照组相比明显降低(P<0.05);与LPS组相比,DADS(低/中/高)+LPS组中NQO-1、HO-1和Υ-GCSc的蛋白表达量随着DADS干预剂量的增加呈现升高趋势(P<0.05),但是SOD的蛋白表达量与LPS组相比并没有明显差异(P＞0.05);与LPS组相比,DADS(低/中/高)+LPS组中HO-1、GCLc和GCLm的mRNA含量呈现升高趋势(P<0.05),但是NQO-1和SOD的mRNA含量与LPS组相比呈现下降趋势(P<0.05)。5.DADS对RAW264.7细胞内活性氧ROS含量的影响:与对照组细胞相比,LPS组细胞内活性氧水平显着增加(P<0.05);而DADS组与对照组之间相比并无明显差异(P>0.05);与LPS组相比,DADS干预组细胞内ROS含量呈现剂量依赖性降低(P<0.05)。6.DADS对LPS诱导RAW264.7细胞内Nrf2蛋白的影响:DADS 100 μM组与对照组相比,细胞内Nrf2的蛋白表达有所增加;LPS组相较对照组可见细胞内Nrf2核转位现象明显;DADS(低/中/高)+LPS组可见细胞内Nrf2核转位现象相比LPS组更加明显。7.DADS对RAW264.7细胞中Nrf2蛋白降解速度的影响:加入放线菌酮抑制Nrf2蛋白质合成后,与对照组相比,DADS 100μM 组的Nrf2蛋白降解速度明显变慢,在15 min、30 min、45 min、60 min时间点Nrf2蛋白分别还剩余了 53.4%、40.7%、23.3%和14.1%。对照组在15 min和30 min时间点Nrf2蛋白分别剩余了48%和9.9%,到45 min和60 min时,已检测不到Nrf2蛋白。8.DADS对RAW264.7细胞中自噬相关蛋白LC3和p62水平的影响与对照组相比,LC3-II的蛋白表达量在DADS处理3 h、6 h、12 h、24 h和48 h时间点均明显降低(P<0.05),并且随着DADS干预剂量的增加呈现降低趋势(PP<0.05);p62的蛋白表达量在DADS处理3h、6h、12 h、24 h和48 h时间点均明显升高(P<0.05),并且在50 μM、100μM DADS干预24 h后相较对照组有所增加(P<0.05)。LPS刺激后LC3-11的表达量与对照组相比并没有统计学差异(P＞0.05),LPS诱导细胞活化后再用DADS进行干预时,其表达量与LPS组相比也没有统计学差异(P>0.05)。在仅用LPS进行诱导时,p62的表达量相比对照组显着增加(P<0.05),LPS刺激后再用DADS干预可以剂量依赖性地降低该刺激引起的p62升高(P<0.05)。研究结论1.大蒜油包含的五种主要有机硫化物中,二烯丙基二硫(DADS)对LPS诱导RAW264.7细胞上清液中NO和炎性细胞因子的抑制作用最强。2.DADS对LPS诱导RAW264.7细胞M1型活化后产生的炎性因子和氧化应激有保护作用,其机制可能与抑制Keap-1蛋白的表达,降低Nrf2降解速度,促进Nrf2入核,增强细胞中HO-1、NQO-1和y-GCSc的表达有关。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-25）
王琼[3]（2019）在《二烯丙基二硫对高脂血症大鼠的降血脂效果和机制研究》一文中研究指出研究目的高脂血症(Hyperlipidemia)是由于脂肪转运或代谢异常所致血浆或血清中一种或者多种脂质高于正常范围的全身性疾病,具体表现为总胆固醇(Total Cholesterol,TC)和/或甘油叁酯(Triglyceride,TG)异常升高。心血管病(CVD,Cardiovascular Diseases)是由于心脏和血液循环障碍引起的一种多因素疾病,是全球死亡的首要原因,高脂血症是其重要诱因之一。对高脂血症的有效治疗,可以减少CVD的发病率和死亡率。目前临床高脂血症多用他汀类降脂药物治疗,但由于他汀类降脂药物长期服用可对人体产生横纹肌溶解症、肝毒性等毒副作用,因此寻找新的安全有效降脂药物具有重要意义。大蒜是百合科葱属植物蒜的鳞茎,有研究表明大蒜及其提取物具有抗菌、抗病毒、降血压、降血脂,防治动脉粥样硬化等多种生物学功效。大蒜油含有二烯丙基一硫(Diallyl sulfide,DAS)、二烯丙基二硫(Diallyl disulfide,DADS)和二烯丙基叁硫(Diallyltrisulfide,DATS)等多种有机硫化合物活性物质,但其中具有降血脂作用的单体成分尚不明确。第一部分实验,根据国家食品药品监督管理局以国食药监保化[2012]107号最新发布的《辅助降低血脂功能检验方法》,通过饲喂Wistar大鼠高脂饲料建立高脂血症模型,研究对比了大蒜的叁种单体成分DAS、DADS和DATS,发现DADS具有良好的降血脂作用,但其作用和机制尚不明确并未见报道。第二部分实验,建立相同高血脂模型,探讨DADS的降血脂作用及其机制,分别给予低、中、高叁种剂量DADS干预,通过相关血脂和肝脏指标评价其干预效果;并进一步分别从代谢和分子生物学角度对DADS发挥作用的机制进行探讨,为高脂血症的预防和治疗提供科学实验依据,也为大蒜制品DADS的进一步开发和利用提供理论依据。第一章DAS、DADS、DATS和大蒜油对高脂血症大鼠降血脂的效果评价和比较研究方法1.高脂饲料维持饲料中添加20.0%蔗糖、15.0%猪油、1.2%胆固醇、0.2%胆酸钠,另加入1.2%磷酸氢钙、0.8%石粉和5.0%酪蛋白达到维持饲料的国家标准。2.实验动物及处理健康雄性Wistar大鼠200±20g,70只,适应性喂养7天后,观察其一般状态,并按体重随机分为溶剂对照组10只,实验组60只;溶剂对照组给予正常饲料,实验组给予高脂饲料。一周后,实验组根据血清TC水平,随机分为高脂模型组、高脂+DAS干预组(160mg/kg.bw)、高脂+DADS干预组(60mg/kg.bw)、高脂+DATS干预组(40mg/kg.bw)、高脂+大蒜油干预组(100mg/kg.bw)和高脂+辛伐他汀对照组(4mg/kg.bw)。DAS、DADS和DATS分别用花生油稀释,溶剂对照组及高脂模型组给予等体积花生油,灌胃体积为1ml/kg.bw,经口灌胃,1次/天,持续4周。处死动物,迅速低温剥离肝脏,称重后剪取肝脏左叶相同部位作为标本用于制备匀浆和油红O染色,其余肝脏备用,均冻存于-80℃冰箱。3.体重和食物利用率测定实验期间,每周称量一次体重,调整灌胃剂量。以周为单位,记录饲料摄入量并按下列公式计算食物利用率:每周食物利用率=平均每只动物每周食物摄入量(g)/该周体重增长量(g)× 100%。4.肝脏系数测定称量动物末次体重及肝脏质量,按照下列公式计算肝脏系数:肝脏系数=肝脏质量(g)/末次体重(g)×1005.血清生化指标测定断头处死大鼠后取血3500 r/min室温离心15min分离血清,全自动生化仪测定TC、TG、HDL-C和LDL-C含量。6.肝脏TG和TC含量测定减量称重法分别称取肝脏左叶相同部位50mg和100mg肝组织,按照试剂盒要求检测TG和TC浓度,BCA法测定肝脏组织匀浆中的总蛋白浓度校正。7.肝脏油红O染色取肝左叶相同部位肝组织,制备10μm冰冻切片。观察脂滴在肝脏内的分布范围和面积,Image-ProPlus 6.0软件分析油红O染色脂滴所占面积比[面积比=脂滴面积/切片面积× 100%]。研究结果1.实验动物体重及肝脏系数变化与溶剂对照组相比,高脂模型组体重无明显差异;与高脂模型组相比,DAS、DADS、DATS和大蒜油各干预组体重也无明显差异。与溶剂对照组相比,高脂模型组肝脏系数无明显差异;与高脂模型组相比,DAS、DADS、DATS和大蒜油各干预组肝脏系数无明显差异。2.实验动物食物利用率变化与高脂模型组相比,给药期间大蒜油干预组动物总食物利用率下降14.81%(P<0.05),其余各组无明显差异。3.实验动物血清脂质相关指标变化与溶剂对照组相比,高脂模型组血清TC,TG,LDL-C浓度分别上升76.57%、115.16%和43.40%(P<0.01)。与高脂模型组相比,DAS干预组血清中TG下降25.88%(P<0.05),HDL-C上升52.57%(P<0.01);DADS干预组血清中TC、TG和LDL-C分别下降23.70%、48.88%和41.04%(P<0.01),HDL-C上升33.67%(P<0.01);DATS干预组血清中TC、TG和LDL-C分别下降17.79%、43.71%和27.11%(P<0.01或0.05),HDL-C上升29.96%(P<0.01);大蒜油干预组血清中TC和TG分别下降16.17%和44.65%(P<0.01或0.05),HDL-C上升32.52%(P<0.01)。4.实验动物肝脏TG和TC变化与溶剂对照组相比,高脂模型组实验动物肝脏TG和TC浓度分别上升133.84%和164.32%(P<0.01)。与高脂模型组相比,DAS干预组实验动物肝脏中TC和TG分别下降52.68%和36.74%(P<0.01);DADS干预组实验动物肝脏中TC和TG分别下降63.64%和51.75%(P<0.01);DATS干预组实验动物肝脏中TC和TG分别下降61.43%和53.91%(P<0.01),大蒜油干预组实验动物肝脏中TC和TG分别下降59.23%和52.04%(P<0.01)。5.实验动物油红O染色变化情况与溶剂对照组相比,高脂模型组镜下可见数量较多且面积较大的红色脂滴着色。与高脂模型组相比,DADS组视野内已无可见明显脂滴,DATS组可见少量脂滴,DAS、大蒜油和辛伐他汀干预组脂滴较其余干预组脂滴数目和面积较大。利用Image-ProPlus 6.0软件分析油红O染色脂滴所占面积比结果可得,与高脂模型组相比,DAS、DADS、DATS、大蒜油干预组分别下降56.10%、96.29%、90.04%和81.18%(P<0.01或0.05)。结论1.4周高脂饮食使得高脂模型组动物血清中TC、TG和LDL-C明显上升,说明混合型高脂血症动物模型建立成功。2.DADS、DATS和大蒜油可降低模型动物血清中TC、TG和LDL-C水平,具有良好的降血脂作用。3.对比DADS、DATS和大蒜油降血脂能力,其中最佳降脂药物为DADS。第二章DADS对高脂血症大鼠的降血脂作用及机制研究研究方法1.实验动物及处理健康雄性Wistar大鼠200±20g,84只,适应性喂养7天后,观察其一般状态,按照体重随机分为溶剂对照组12只,DADS对照组12只和实验组60只,溶剂对照组给予正常饲料,实验组给予高脂饲料。7天后,实验组动物根据血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平,随机分为高脂模型组、高脂+DADS低、中、高剂量干预组(15、30、60mg/kg.bw)、高脂+辛伐他汀对照组(8mg/kg.bw)。DADS用花生油稀释,辛伐他汀用蒸馏水制成混悬液,溶剂对照组、DADS对照组和高脂模型组给予等体积花生油,灌胃体积为1 ml/kg.bw,经口灌胃,1次/天,持续5周。处死动物,迅速低温剥离肝脏,称重后剪取肝脏左叶相同部位作为标本用于制备匀浆、HE染色(10%福尔马林溶液浸泡)和油红O染色,其余肝脏冻存于-80℃冰箱备用。迅速分离附睾脂肪、棕色脂肪、皮下脂肪、肠系膜脂肪和肾周脂肪,称重后冻存于-80℃冰箱备用。体重、食物利用率、肝脏系数、血清生化指标、肝脏TG和TC含量和肝脏油红O染色方法同第一章。2.肝脏HE染色石蜡切片脱蜡至水,Mayer氏苏木素染色1分钟后,用自来水冲洗5～10分钟,75%乙醇盐酸分化液分化1-2分钟,用自来水冲洗0.5～1分钟。伊红染液复染1分钟,用自来水冲洗0.5～1分钟。乙醇梯度脱水透明,封片后,BX53 Olympus显微镜进行观察和图片采集。3.血清和肝脏组织匀浆中MDA浓度测定断头处死大鼠后取血3500r/min室温离心15min,移取上清至另一新的1ml离心管中,适量生理盐水稀释2倍后即可作为样本进行检测。肝脏组织使用冰浴PBS,按照1:9(mg:μL)的比例进行匀浆。留取部分匀浆液进行总蛋白定量,10,000g-12,000g离心10分钟取上清用于后续测定,适量PBS稀释2倍后即可作为样本利用试剂盒进行检测。4.血浆和肝组织匀浆中SOD酶活性测定抗凝管收集血液,颠倒混匀。4℃600g离心10分钟,移取上清,适量生理盐水稀释2倍后作为样本检测。肝脏组织样品的准备:取适量的组织样品,按照每10mg组织加入100微升SOD样品制备液的比例在4℃进行匀浆。留取部分匀浆液进行总蛋白定量,剩余4℃约12,000g离心5分钟,取上清作为待测样品利用试剂盒进行检测5.血清和肝组织匀浆中GSH和GSSG浓度测定血清和肝组织匀浆中GSH和GSSG浓度用碧云天公司的试剂盒进行检测6.Western blot检测肝脏相关蛋白的表达水平Western blot检测实验动物肝脏中氧化应激相关蛋白和脂质代谢相关蛋白的表达水平,用Image Pro-Plus 6.0分析胶片上的条带的积分光密度,并用P-actin校正。研究结果1.实验动物一般情况和体重变化实验期间,大鼠五周体重均值差异无统计学意义。2.实验动物食物利用率变化第1、2、3周和总食物利用率的均值差异无统计学意义。3.实验动物脏器系数与溶剂对照组和高脂模型组相比,DADS高剂量干预组肝脏系数升高(P<0.01)。与溶剂对照组和高脂模型组相比,DADS对照组、辛伐他汀对照组脾脏系数升高(P<0.01)。4.实验动物各部分脂肪系数与溶剂对照组相比,高脂模型组肾周、附睾、肠周和皮下脂肪系数分别上升21.06%、13.14%、41.79%和24.46%(P>0.05或P<0.01)。与高脂模型组相比,DADS高剂量肾周脂肪系数干预组下降25.61%(P<0.01);DADS低、中、高剂量干预组附睾脂肪系数分别下降14.78%、10.24%和26.90%(P<0.01或0.05或P>0.05);DADS低、中、高剂量干预组肠周脂肪系数分别下降5.68%、10.65%和22.38%(P<0.01或0.05或P>0.05)。DADS低、中、高剂量干预组皮下脂肪系数分别下降30.81%、15.78%和50.63%(P<0.01或0.05或P>0.05)。5.实验动物血清脂质相关指标及动脉粥样硬化指数与溶剂对照组相比,高脂模型组TG,TC,LDL-C浓度分别上升76.26%,32.42%和83.72%(P<0.01),AI上升51.39%(P<0.01)。与高脂模型组相比,DADS低、中、高剂量干预组TG浓度分别下降28.69%、30.32%和46.59%(P<0.01或0.05);DADS低、中、高剂量干预组TC浓度分别下降18.87%、21.51%和24.90%(P<0.01);DADS中、高剂量干预组HDL-C浓度分别上升17.22%和28.97%(P<0.01或0.05);DADS低、中、高干预组LDL-C浓度分别下降29.28%、34.60%和47.81%(P<0.01);DADS低、中、高干预组AI分别下降38.70%、49.16%和59.54%(P<0.01)。6.肝脏TG和TC浓度变化与溶剂对照组相比,高脂模型组大鼠肝脏TG和TC浓度分别上升152.47%和156.76%(P<0.01)。与高脂模型组相比,DADS低、中、高剂量干预组TG浓度分别下降42.99%、51.25%和53.29%(P<0.01);DADS低、中、高剂量干预组TC浓度分别下降54.03%、62.78%和63.43%(P<0.01)。7.肝脏HE染色HE染色后,溶剂对照组大鼠肝脏细胞形态正常,肝小叶结构基本正常。高脂模型组大鼠肝脏镜下可见弥漫性肝细胞脂肪变性。DADS各干预组镜下肝脏脂变程度轻,少数肝细胞有小泡型脂滴,部分肝细胞呈轻度浊肿,肝窦轻度变窄。DADS高剂量组有显着改善,肝窦清晰,肝索排列整齐,无炎性细胞浸润。8.肝脏油红O染色溶剂对照组和DADS对照组肝脏细胞排列均匀,无可见脂滴。与溶剂对照组相比,高脂模型组镜下可见较多红色脂滴。与高脂模型组相比,DADS各干预组和辛伐他汀对照组红色脂滴不同程度减少,DADS高剂量组视野内已无可见明显脂滴。Image ProPlus 6.0软件分析油红O染色脂滴所占面积比的结果,与高脂模型组相比,DADS低、中、高剂量干预组和辛伐他汀对照组分别下降74.36%、93.20%、98.93%、和72.73%(P<0.01)。9.肝脏氧化抗氧化指标与溶剂对照组相比,高脂模型组MDA浓度上升2241.88%(P<0.01);SOD活性下降19.92%(P<0.05);GSH浓度下降45.96%(P<0.05),GSSG浓度下降74.07%(P<0.05)。与高脂模型组相比,DADS中、高剂量干预组和辛伐他汀对照组MDA浓度分别下降21.27%、44.62%和26.38%(P<0.01或0.05);DADS高剂量干预组SOD活性上升23.39%(P<0.05);DADS低、中、高干预组GSH浓度分别上升16.76%、41.92%和49.50%(P<0.01或0.05)。10.血清氧化抗氧化指标与溶剂对照组相比,高脂模型组MDA浓度上升140.55%(P<0.01),SOD活性下降56.08%(P<0.01);与高脂模型组相比,DADS低、中、高剂量干预组MDA浓度分别下降45.25%、53.19%和57.96%(P<0.01 或0.05);DADS低、中、高剂量干预组SOD活性上升101.83%、102.37%和117.95%(P<0.01);DADS低、中、高剂量干预组GSH浓度分别上升89.41%、119.62%和146.48%(P<0.01);DADS低、中、高剂量干预组GSSG浓度分别上升50.58%、97.54%和111.82%(P<0.01)。11.肝细胞内氧化应激相关蛋白表达的改变与溶剂对照组相比,高脂模型组肝脏Nrf2蛋白相对表达水平下降9.86%(P>0.01);NQ01表达水平下降39.95%(P>0.05);γ-GCSc表达水平下降36.12%(P<0.05);γ-GCSm表达水平升高169.58%(P<0.05);SOD-1蛋白相对表达水平下降29.95%(P>0.05)。与高脂模型组相比,DADS低、中、高剂量干预组肝脏Nrf2蛋白相对表达水平分别上升158.93%、56.35%和71.28%(P<0.01或0.05);NQO1表达水平分别上升505.01%、600.67%和1024.94%(P<0.01或0.05或P>0.05);y-GCSc表达水平分别上升71.77%、67.78%和91.34%(P<0.01或0.05);γ-GCSm表达水平分别上升17.27%、39.82%和138.25%(P<0.01或P>0.05);SOD-1蛋白表达水平分别上升102.20%、136.86%和113.55%(P<0.01或0.05)。12.肝细胞内脂肪酸代谢相关蛋白表达的改变与溶剂对照组相比,高脂模型组肝脏p-SREBP-1c蛋白相对表达升高45.56%(P<0.01);n-SREBP-1c蛋白相对表达水平升高93.48%(P<0.01);PPAR-α蛋白相对表达下降17.44%(P<0.05)。高脂模型组相比,DADS低、中、高剂量干预组肝脏p-SREBP-1c蛋白表达水平分别下降34.68%、75.52%和63.48%(P<0.011)。n-SREBP-1c蛋白表达水平分别下降46.52%、69.83%和71.28%(P<0.01);DADS低、高剂量干预组肝脏PPAR-α蛋白相对表达上升42.78%和119.81%(P<0.05或P>0.05)。结论1.连续5周高脂饮食导致高脂模型组动物血清中TC、TG和LDL-C明显上升,可判定混合型高脂血症动物模型建立成功。2.DADS各剂量组可降低模型动物血清中TC、TG和LDL-C水平,证明其具有良好的降血脂作用。3.DADS改善动物肝脏氧化应激水平,从而减轻脂质过氧化,与激活Keap1/Nrf2通路,并上调下游蛋白相关蛋白NQO1、y-GCSc、SOD-1表达水平有关。4.DADS有可能通过下调SREBP-1c的表达,从而抑制肝脏TG及相关脂质的合成;上调肝脏细胞PPAR-α蛋白表达,加快TG分解及脂肪酸的氧化代谢,从而改善实验动物高脂血症。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-25）
王一芳,侯红漫,张公亮,卢美杉,王越[4]（2019）在《二烯丙基二硫醚对蜂房哈夫尼菌群体感应的抑制作用》一文中研究指出以从海参中分离的优势腐败菌蜂房哈夫尼菌为对象,研究了二烯丙基二硫醚(DADS)对受其群体感应调控的生物膜及泳动性的抑制作用。采用CV026报告菌定性检测DADS的抗群体感应活性,利用96微孔板法、扫描电镜(SEM)和琼脂扩散法分析DADS对蜂房哈夫尼菌生物膜及泳动性的抑制作用。结果表明,DADS作用于蜂房哈夫尼菌和CV026的最低抑菌浓度是48 mmol/L。在亚抑菌浓度下,与未处理对照组相比,DADS能够抑制由群体感应调控的CV026中紫色素的分泌而不抑制其生长。在0～12 mmol/L,随着浓度增加,DADS对生物膜的抑制率可达49.6%,对泳动性的抑制率达到73.5%。在12 mmol/L时,DADS能够抑制生物膜的形成。DADS能够抑制蜂房哈夫尼菌的群体感应活性、生物膜及泳动性,从而发挥防腐功效。(本文来源于《大连工业大学学报》期刊2019年03期）
唐仪,唐云云,刘芳,苏坚,夏红[5]（2019）在《二烯丙基二硫诱导人胃癌MGC803细胞的差异microRNA表达》一文中研究指出目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人胃癌MGC803细胞的差异miRNAs表达。方法采用miRNAs芯片与qRT-PCR检测DADS诱导人胃癌MGC803细胞的差异miRNAs表达。结果 microRNA芯片检测显示,30 mg·L~(-1)DADS处理24 h后,MGC803细胞的差异miRNAs表达中,miR-200b、miR-22、miR-7、miR-143、miR-138、miR-34a、miR-150等7个miRNA表达明显上调,miR-222、miR-21、miR-15b、miR-182、miR-18a等5个miRNA下调。q PCR证实,30 mg·L~(-1)DADS处理MGC803细胞后,miR-200b、miR-22、miR-7、miR-143、miR-138、miR-34a、miR-150等表达较未处理组明显上调(P <0. 05)。且q PCR检测显示,miR-200b与miR-22在MGC-803、BGC-823、MKN-28、SGC-7901、HGC-27等各种人胃癌细胞表达较正常人胃癌GES-1细胞明显下调(P <0. 05)。miR-200b与miR-22在胃癌组织中表达较正常胃组织明显下调(P <0. 05)。结论DADS诱导人胃癌MGC803细胞的差异miRNAs表达有7个miRNA明显上调,5个miRNA下调。miR-200b与miR-22在胃癌组织与细胞中表达下调。DADS可上调MGC803细胞miR-200b与miR-22表达。(本文来源于《中国药理学通报》期刊2019年06期）
王琼,马晓敏,黎显杰,厉铭,于婷[6]（2019）在《二烯丙基二硫对高脂血症大鼠的降血脂作用及其抗氧化机制研究》一文中研究指出目的明确二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)降血脂效果及其机制。方法健康雄性Wistar大鼠84只,适应性喂养7 d后,随机分为空白对照组12只,DADS对照组12只和实验组60只。实验组采用高脂饲料饲喂养7 d后实验组根据大鼠血清甘油叁酯(triglyceride, TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)水平,随机分为高脂模型组、高脂+DADS低、中、高剂量干预组(15、30和60 mg/kg·bw)、高脂+辛伐他汀对照组(8 mg/kg·bw),经口灌胃,1次/d,连续35 d。处死动物,检测血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C含量和肝中TG和TC含量;肝冰冻切片油红O染色观察脂肪沉积情况。检测血清和肝匀浆中SOD活力,丙二酯(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量。结果与高脂模型组相比,DADS各干预组TC、TG和LDL-C浓度下降(P<0.01或P<0.05),HDL-C浓度上升(P<0.01);肝匀浆的TG和TC浓度下降(P<0.01);油红O染色脂滴数目和面积明显减少;血清和肝匀浆中SOD活性增强,GSH浓度上升,MDA浓度下降(P<0.01或P<0.05)。DADS高剂量干预组、DADS对照组和辛伐他汀对照组可见肝脏系数和脾脏系数升高(P<0.01或P<0.05),显示毒性反应。结论 DADS具有明显降血脂的作用,其作用与抗脂质过氧化和抑制氧化应激有关。(本文来源于《毒理学杂志》期刊2019年01期）
张志军,张方圆,王李平,林晨,汤逊尤[7]（2018）在《气相色谱法测定腌制大蒜中二烯丙基叁硫醚和二烯丙基二硫醚》一文中研究指出建立腌制大蒜中二烯丙基叁硫醚(DATS)和二烯丙基二硫醚(DADS)的气相色谱测定法。样品经前处理后,用DB-1701毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)分离,FID检测器检测。在优化的色谱条件下,DATS和DADS分离度好,DATS在416.8μg/mL~8.335 mg/mL浓度范围内,DADS在256.6μg/mL~5.132 mg/mL浓度范围内均呈良好的线性;DATS和DADS的检出限分别为0.0055mg/kg和0.0051 mg/kg;两者的回收率分别为97.9%~105.1%和98.1%~112.5%;相对标准偏差(RSD,n=6)分别为1.24%和2.13%。该方法准确可靠,重现性好,适用于大蒜中大蒜素含量的测定。(本文来源于《山东化工》期刊2018年16期）
吉晓霞,刘芳,夏红,何洁,谭晖[8]（2018）在《二烯丙基二硫下调MCL-1诱导K562细胞G_2/M阻滞及其机制》一文中研究指出目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)下调MCL-1诱导人白血病K562细胞周期阻滞及其机制。方法:采用CCK-8检测DADS对K562细胞增殖的作用;流式细胞术观察DADS与沉默MCL-1对K562细胞周期的影响;Western blot检测MCL-1、PCNA和CDK1表达;免疫共沉淀方法分析MCL-1与PCNA及CDK1结合作用。结果:15、30、60、120、240μmol/L DADS对K562细胞增殖抑制率分别为32.48%、59.34%、66.42%、77.06%和81.05%(P<0.05)。60和120μmol/L DADS分别作用K562细胞24和48 h后,G_2/M期细胞分别增加到18.6%与34.4%和17.5%与28.5%(P<0.05)。沉默MCL-1可阻滞K562细胞于G_2/M,沉默MCL-1加DADS(60μmol/L)较单独DADS和沉默MCL-1明显增强(P<0.05)。DADS可明显下调MCL-1、PCNA与CDK1表达(P<0.05)。DADS处理K562细胞8 h,MCL-1与结合的PCNA和CDK1较对照组显着下调(P<0.05)。结论:DADS可通过下调MCL-1继而降低PCNA与CDK1表达,抑制K562细胞增殖,细胞阻滞于G_2/M期,沉默MCL-1可增强DADS的作用。(本文来源于《中国实验血液学杂志》期刊2018年03期）
谢淇霖[9]（2018）在《二烯丙基二硫（DADS）通过SIRT1影响人结肠癌细胞凋亡和转移的研究》一文中研究指出结肠癌是一种好发于直肠与乙状结肠交界处的消化道恶性肿瘤疾病,以40~50岁是结肠癌高发的年龄段,其发病率中女性和男性的比例为1:2~3,在胃肠道肿瘤发病率中位居全球第3位。目前,外科手术联合化疗疗法是结肠癌治疗的主要措施,化疗可以提高手术成功率,降低疾病复发率,提高患者的生存率。但是,化疗药物在对肿瘤细胞产生影响的同时,也会对正常组织细胞造成不同程度的伤害,从而导致大部分结肠癌患者在治疗过程当中放弃甚至是死亡。因此,寻找高效果、低毒性的抗癌药物成为当前研究的热点。大蒜是一种常见的食材,但早在东汉末年医书中就已经记载过大蒜的医用价值。唐代医家李时珍所着的《本草纲目》记载:大蒜性温,味辛;入脾、胃、肺经,具有温中消食、行滞气、暖脾胃、消积、解毒、杀虫的功效。大蒜被誉为“地里面长出的青霉素”和“天然的抗生素”,这是因为大蒜里含有大蒜素的原因。二烯丙基二硫(DADS)是大蒜素在分解后得到一种有机硫化合物,有剧烈的蒜臭味,呈现淡黄色液体,不可溶于水,是一种脂溶性单体化合物。目前研究发现DADS的主要作用包括:解毒、抗菌、阻止心血管疾病和抵御结肠癌。前3种作用已经广为人知了,但DADS在结肠癌的研究报道中却鲜少提及。去乙酰化酶(Sirtuins)家族成员中的组蛋白脱乙酰酶-沉默信息调节因子1(silent information regulator1,SIRT1)是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),在体内以多种组蛋白、非组蛋白为底物,通过去乙酰化作用来调节活性的一种组蛋白脱乙酰酶。SIRT1广泛参与调控哺乳动物细胞寿命的信号及糖代谢、胰岛素分泌等多条代谢通路,对代谢综合征、细胞凋亡、心血管疾病和神经退行性疾病等发挥重要的作用。同时,在大部分与肿瘤相关的文献中均提到SIRT1,如:白血病、成胶质细胞瘤、前列腺癌、原发性结直肠癌、皮肤癌等。SIRT1在鳞状细胞癌、基底细胞癌中也明显高于正常皮肤组织。大量的科研成果证实,近些年来,学术界倍受研讨、青睐的细胞核转录因子之一的NF-кB(nuclear factor-kappaB)参与肿瘤细胞病变、繁殖、分裂、死亡、转侵的全过程。NF-кB脱乙酰化可以通过NAD+辅助SIRT1来实现,IкBα无法再与这时的NF-кB发生反应,进而隔绝核定位信号,阻碍肿瘤细胞病变、转侵等特定基因的形成。除此之外,与肿瘤的转侵密切相关的还有基金属蛋白酶家族(MMPs)。研究报道中指出,SIRT1是MMPs家族中MMP-9基因转录和翻译发生的一个诱导因素。亦有报道指出,细胞核内MMP-9基因的合成可由磷酸化的NF-кB与MMP-9启动子的直接结合来调节。由此可见,SIRT1、NF-кB以及MMP-9均与肿瘤的发生、转移、凋亡密切相关,且叁者各自之间又有着紧密的联系。那我们可以尝试通过二烯丙基二硫(DADS)影响SIRT1,从而促使人结肠癌细胞凋亡和转移。研究步骤如下:先将结肠癌细胞株HT-29进行体外培养,DADS按0、30、60、120μmol·L-1不同剂量分别加入之后继续培养48 h。采用不同的方法对DADS作用下细胞HT-29的不同反应进行检测。包括CCK-8法检测存活性,Transwell法和划痕法检测体外细胞转侵,RT-PCR和Western Blot检测在Nampt(10μg·L-1)和DADS(0、30、60、120μmol·L-1)剂量影响下,细胞蛋白SIRT1、NF-кB、MMP-9所产生的变化。第二步,把细胞HT-29打入30天大的试验饲养的Balb/c小鼠腹部,等到种植细胞产生的肿瘤长到5mm以后,再用剂量为(1mg/Kg)的DADS每天喂药一次进行试验性药物检测,并做好试验鼠体重与肿瘤大小在每天药物作用之下变换的记录。28天之后采集样本,对结肠肿瘤发生转移的个数进行统计;采用HE对瘤细胞染色记录形状所发生的变换,SIRT1、NF-кB/P65、MMP-9蛋白用免疫组化和Western Blot检测并做好记录。结果显示:1、HT-29在DADS分别(0、30、60、120μmol·L-1)剂量影响48h以后,随着计量的增大,逐渐有效的控制细胞的增殖(P<0.05),在一定程度上出现了对药物产生了依赖。2.DADS能够抑制HT-29细胞内SIRT1、MMP-9mRNA和蛋白的表达,促进NF-кB mRNA和蛋白的表达。3.DADS能够有效的控制试验鼠体内荷瘤细胞的繁殖,促进细胞中核缩减。数据如下:DADS组试验鼠的重量为(26.71±1.54)g,瘤体积(841.98±112.51)mm~3,瘤体重量(0.83±0.33)g;而模型组与之对应的数据分别为(16.78±0.97)g、(1493.48±210.90)mm~3、(2.85±0.97)g,其叁组数据的统计差异均(P<0.01),有统计学意义。4.解剖小鼠后发现,灌喂DADS组小鼠肿瘤体积明显小于对照组小鼠肿瘤体积。能够有效的控制试验鼠体内荷瘤细胞的繁殖,促进细胞中核缩减。体内外两种不同试验结果表明,DADS可以通过对SIRT1所产生的影响,抑制SIRT1,可以刺激NF-кB蛋白表达,下调MMP-9的表达来从而调控结肠癌细胞的转移与凋亡。(本文来源于《武汉工程大学》期刊2018-03-30）
许帅,李细霞,王敏,李署平,廖伟雄[10]（2018）在《二烯丙基二硫对小鼠生精细胞的辐射防护作用》一文中研究指出目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对小鼠生精细胞的辐射防护效应。方法利用4Gy剂量X射线建立动物辐射损伤模型。观察辐照小鼠睾丸组织变化、精子活力及精子畸形率,检测蛋白质羰基含量、丙二醛(MDA)及8-羟基脱氧鸟苷(8-OHd G)含量,评估生精细胞的辐照损伤程度及DADS对生精细胞的防护效果。测定睾丸组织抗氧化酶系超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力及谷胱甘肽(GSH)含量,western blot检测Nrf2信号蛋白表达,探讨DADS的辐射防护机制。结果与单纯照射组相比,DADS预处理组睾丸组织损伤较轻,精子活力显着提高(P<0.05),精子畸形率降低(P<0.05),蛋白质羰基含量、MDA及8-OHd G水平明显下降(P<0.05)。SOD、CAT、GSH-Px及GSH等抗氧化指标显着提升(P<0.05),Nrf2表达明显增强。结论 DADS通过其抗氧化能力对雄性小鼠生精细胞急性辐射损伤具有一定的防护效应。(本文来源于《中国比较医学杂志》期刊2018年04期）
二烯丙基二硫醚论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究目的肝脏是酒精进入人体后主要的代谢场所,也是其毒害的首要靶器官,长期大量饮酒会导致酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)。疾病初期通常表现为可逆性的酒精性脂肪肝,若不加以控制和干预,可进一步发展成酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。严重酗酒时甚至可诱发广泛的肝细胞坏死,进而发展为肝衰竭和肝癌(hepatocellular carcinoma)。ALD是一种涉及多种发病机制的多因素疾病,目前并没有有效的药物治疗措施。现阶段对于ALD的发病机制已经有了多种研究和假设,其中乙醇暴露引起肝脏内枯否细胞活化和肝脏内氧化应激,已经被证实在ALD的发病过程中起到要作用。枯否细胞(Kupffer cells,KCs)是肝脏内的常驻巨噬细胞,在多种肝脏疾病的发生发展中都起到不可忽视的作用。乙醇暴露引起肠源性内毒素大量进入肝脏,导致肝脏KCs发生Ml型活化,可以释放大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-a(Tumor necrosis factor,TNF-a)等,对肝脏造成损伤。此外,过量乙醇在肝脏中代谢时,在细胞色素P450 2E1(Cytochrome P450 2E1,CYP2E1)和NADPH氧化酶(NADPH oxidative enzymes,NOX)的作用下,也可以生成大量活性氧和活性氮,造成肝脏氧化应激损伤。核转录因子E2相关因子2(Nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)是机体调节氧化应激的重要靶点,可以调控肝脏中解毒和抗氧化防御相关基因的表达。Nrf2可以通过促进多种Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达来诱导机体内源性的抗氧化防御,是目前发现的促进细胞抗氧化防御最重要的途径之一。通过激活Nrf2信号通路来保护包括乙醇在内的各种化学物质引起的肝损伤已经成为预防肝脏疾病的新策略。大蒜油(Garlic oil,GO)是一种通过蒸汽蒸馏制取的大蒜产品,具有许多有益的生物学活性。实验证明,大蒜具有多种药理作用,其中包括抗氧化、抗炎、抗癌、免疫调节、降低血压和控制血糖,以及对各种外源化学物引起的肝损伤具有一定的保护作用。研究发现GO可以有效的抑制乙醇诱导的氧化应激,其含有五种主要的有机硫化物(Organosulfur compounds,OSCs),这些OSCs也被发现可以引起HepG2细胞中Nrf2/HO-1途径的活化。那么GO中的有机硫化物是否能够减轻枯否细胞Ml型极化后造成的炎性因子分泌和氧化应激?发挥主要作用的成分是哪一种?其机制是否与Nrf2信号通路有关?这些都是尚未明确的问题。本实验拟通过LPS刺激RAW264.7细胞,建立KCs发生M1型活化的模型,利用酶联免疫吸附法(ELISA)和活性氧试剂盒对GO含有的五种有机硫化物中能够有效减轻KCs活化后引起的氧化应激和致炎因子大量分泌的有效成分进行筛选。同时,利用免疫印迹法(Western Blotting)和qRT-PCR法对Nrf2-Keapl信号通路相关蛋白及mRNA的含量进行检测,观察其能否引起Nrf2-Keapl信号通路的变化,探讨其在预防ALD发病中的可能作用,为ALD的防治提供新的思路和策略。研究方法1.采用CCK-8法检测大蒜油中五种主要有机硫化物对于RAW264.7细胞的细胞毒性,在安全剂量范围内选择高中低叁种剂量作为给药剂量。2.将RAW264.7细胞分为对照组、LPS组和不同剂量有机硫化物干预组。对照组不作任何处理,LPS组用1 μg/mL LPS诱导RAW264.7细胞活化;干预组先用不同浓度的有机硫化物孵育2 h,然后再加入1 μg/mL的LPS共同培养24h。24h后收集细胞上清液,用ELISA法检测细胞培养上清中炎性细胞因子包括TNF-a、IL-1β、IL-10等的水平,Griess Reagent法检测细胞上清液中NO浓度。根据上述结果筛选能够有效抑制LPS诱导后RAW264.7细胞分泌炎性细胞因子和一氧化氮的有机硫化物。3.筛选出DADS作为主要研究对象,以100μM DADS作为给药剂量,分别在DADS处理0h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h时提取细胞总蛋白和总RNA;Western Blotting法和qRT-PCR法检测 Nrf2、keap-1、NQO-1、SOD、ΥΥ-GCSc、HO-1、LC3、p62在不同时间段的蛋白和mRNA的表达水平。4.分别以0μM、2.5 μM、5 μM、12.5 μM、25 μM、500μM、100μMDADS处理RAW264.7细胞,24 h后提取细胞总蛋白和总RNA;Western Blotting法和qRT-PCR法检测在不同剂量DADS干预下Nrf2、keap-1、NQO-1、SOD、Υ-GCSc、HO-1、LC3、p62的蛋白和mRNA的表达水平。5.将RAW264.7细胞分为对照组、LPS组和LPS+(高/中/低)DADS组。对照组不作任何处理,LPS组用1 μg/mL LPS诱导,另外3组加入不同浓度DADS使浓度分别为25 μM、50 μM和100 μM,培养2 h后再用1 μg/mL LPS诱导。24h后提取细胞总蛋白和总RNA,Western Blotting法和qRT-PCR法检测Nrf2、keap-1、NQO-1、SOD、y-GCSc、HO-1、LC3、p62的蛋白和mRNA的表达水平；;制备细胞爬片,免疫荧光法检测细胞中Nrf2蛋白的变化情况;荧光探针孵育后收集细胞混悬液检测细胞中活性氧ROS的含量。6.将RAW264.7细胞分为5个对照组和5个DADS处理组,对照组不做任何处理,DADS组以100μM DADS处理24 h。然后两组中分别加入50 μM的放线菌酮处理0 min、15 min、30 min、45 min、60 min后提取细胞总蛋白,Western Blotting检测DADS干预对于Nrf2蛋白的降解速度是否有影响。研究结果1.五种有机硫化物的安全剂量:各剂量组的RAW264.7细胞活力在90%以上(P＞0.05)时视为细胞活性未受到明显影响,即为该种有机硫化物的安全剂量范围。DATS安全剂量范围为0～25μM;DADS安全剂量范围为0～150 μM;DAS安全剂量范围为0～1600μM;AMTS安全剂量范围为0～100 μM;AMDS安全剂量范围为0～200 μM。本实验浓度下的DATS/DADS/DAS/AMTS/AMDS对细胞均无明显毒性。2.五种有机硫化物对LPS诱导RAW264.7细胞分泌的炎性因子的影响:LPS组细胞上清液中炎性因子的水平均高于对照组(P<0.05);DATS/DADS+LPS组细胞上清液中NO、TNF-a、IL-1p的浓度较LPS组明显降低(均P<0.05),并呈剂量依赖性;DAS+LPS组细胞上清液中只有IL-lβ的含量有所下降(P<0.05);AMTS+LPS组细胞上清液中NO和TNF-αa的含量有所下降(P<0.05);AMDS+LPS组的细胞上清液中仅NO的含量有所下降(P<0.05)。3.不同时间、不同剂量DADS干预对RAW264.7细胞内Nrf2信号通路相关分子蛋白和mRNA水平的影响:与对照组相比,Nrf2蛋白表达量在DADS处理3 h、6 h、12 h和24 h时间点均明显升高(P<0.05),并且随着DADS干预剂量的增加呈现升高趋势(P<0.05);keap-1蛋白表达量在DADS处理3 h、6 h、12 h、24 h和48 h时间点均明显降低(P<0.05),并且随着DADS干预剂量的增加呈现降低趋势(P<0.05);NQO-1、HO-1和Υ-GCSc的蛋白表达量在DADS处理3h、6h、12 h、24 h和48h时间点均明显升高(P<0.05),并且随着DADS干预剂量的增加呈现升高趋势(P<0.05);SOD的蛋白表达量在不同剂量的DADS处理任何时间点与对照组相比均无明显差异(P>0.05)。qRT-PCR测定结果表明,与对照组相比,Nrf2的mRNA含量在DADS处理3 h、6 h、12 h和24 h时间点均明显降低(P<0.05),在不同剂量DADS处理后也明显降低(P<0.05);keap-1的mRNA含量在DADS处理3 h、6 h、12 h和24 h时间点均明显降低(PP<0.05),在不同剂量的DADS处理后也明显降低(P<0.05);NQO-1、HO-1、GCLm和GCLc的mRNA含量在DADS处理3h、6h、12 h和24 h时间点均明显升高(P<0.05),在不同剂量的DADS处理后也明显升高(P<0.05)。但是SOD的mRNA含量在不同剂量的DADS处理任何时间点与对照组相比均无明显差异(P＞0.05)。4.不同剂量DADS干预对LPS诱导后RAW264.7细胞内Nrf2信号通路相关分子蛋白和mRNA含量的影响:Western blotting和qRT-PCR测定结果表明,与对照组相比,LPS组中Nrf2和Keap-1的蛋白表达水平都显着降低(P<0.05),两种蛋白的mRNA含量也显着降低(P<0.05);与LPS组相比,DADS(低/中/高)+LPS组中Nrf2的蛋白表达量表现为上升趋势(P<0.05),keap-1的蛋白表达量相比LPS组则有所下降(P<0.05),但是两种蛋白的mRNA含量与LPS组相比均没有显着差异(P>0.05);与对照组相比,LPS组的NQO-1 和Υ-GCSc的蛋白表达量均显着降低(P<0.05),但LPS组的HO-1蛋白表达量与对照组相比明显增加(P<0.05),LPS组SOD蛋白的表达量与对照组相比无统计学差异(P>0.05);与对照组相比,LPS组的NQO-1、HO-1、SOD和GCLm的mRNA含量均有显着升高(P<0.05),但LPS组GCLc的mRNA含量与对照组相比明显降低(P<0.05);与LPS组相比,DADS(低/中/高)+LPS组中NQO-1、HO-1和Υ-GCSc的蛋白表达量随着DADS干预剂量的增加呈现升高趋势(P<0.05),但是SOD的蛋白表达量与LPS组相比并没有明显差异(P＞0.05);与LPS组相比,DADS(低/中/高)+LPS组中HO-1、GCLc和GCLm的mRNA含量呈现升高趋势(P<0.05),但是NQO-1和SOD的mRNA含量与LPS组相比呈现下降趋势(P<0.05)。5.DADS对RAW264.7细胞内活性氧ROS含量的影响:与对照组细胞相比,LPS组细胞内活性氧水平显着增加(P<0.05);而DADS组与对照组之间相比并无明显差异(P>0.05);与LPS组相比,DADS干预组细胞内ROS含量呈现剂量依赖性降低(P<0.05)。6.DADS对LPS诱导RAW264.7细胞内Nrf2蛋白的影响:DADS 100 μM组与对照组相比,细胞内Nrf2的蛋白表达有所增加;LPS组相较对照组可见细胞内Nrf2核转位现象明显;DADS(低/中/高)+LPS组可见细胞内Nrf2核转位现象相比LPS组更加明显。7.DADS对RAW264.7细胞中Nrf2蛋白降解速度的影响:加入放线菌酮抑制Nrf2蛋白质合成后,与对照组相比,DADS 100μM 组的Nrf2蛋白降解速度明显变慢,在15 min、30 min、45 min、60 min时间点Nrf2蛋白分别还剩余了 53.4%、40.7%、23.3%和14.1%。对照组在15 min和30 min时间点Nrf2蛋白分别剩余了48%和9.9%,到45 min和60 min时,已检测不到Nrf2蛋白。8.DADS对RAW264.7细胞中自噬相关蛋白LC3和p62水平的影响与对照组相比,LC3-II的蛋白表达量在DADS处理3 h、6 h、12 h、24 h和48 h时间点均明显降低(P<0.05),并且随着DADS干预剂量的增加呈现降低趋势(PP<0.05);p62的蛋白表达量在DADS处理3h、6h、12 h、24 h和48 h时间点均明显升高(P<0.05),并且在50 μM、100μM DADS干预24 h后相较对照组有所增加(P<0.05)。LPS刺激后LC3-11的表达量与对照组相比并没有统计学差异(P＞0.05),LPS诱导细胞活化后再用DADS进行干预时,其表达量与LPS组相比也没有统计学差异(P>0.05)。在仅用LPS进行诱导时,p62的表达量相比对照组显着增加(P<0.05),LPS刺激后再用DADS干预可以剂量依赖性地降低该刺激引起的p62升高(P<0.05)。研究结论1.大蒜油包含的五种主要有机硫化物中,二烯丙基二硫(DADS)对LPS诱导RAW264.7细胞上清液中NO和炎性细胞因子的抑制作用最强。2.DADS对LPS诱导RAW264.7细胞M1型活化后产生的炎性因子和氧化应激有保护作用,其机制可能与抑制Keap-1蛋白的表达,降低Nrf2降解速度,促进Nrf2入核,增强细胞中HO-1、NQO-1和y-GCSc的表达有关。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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标签：RORα; 二烯丙基二硫; 人胃癌MGC803细胞; 增殖;