摘 要：在日常的法医物证工作中，常规检材，如血样、口腔拭子等我们用Chelex法提取DNA能够得到比较理想且完整的实验结果，而像牙刷、饮水瓶等微量检材和腐败的尸体检材，如腐败尸体指甲等亦十分常见，为使法医物证工作能顺利展开，一般可以使用ML-超微量磁珠法DNA提取试剂盒提高DNA检验水平，本次实验主要探讨磁珠法和Chelex在微量或腐败检材DNA检验中的效果差异。
关键词：ML-超微量磁珠法DNA提取试剂盒；微量检材；腐败检材；DNA检验
0 引言
现如今，制约接触DNA检验成功率的瓶颈在于接触DNA检材的发现与提取方面，如何从微量检材中提取到足够的DNA，以此满足医学检验需求，选择合适的DNA提取方法至关重要。通过ML-超微量磁珠法的应用能够提升DNA提取效率，提高检验水平，将ML-超微量磁珠法与Chelex法相结合，能够明确了解两种方法在DNA检验中的实际差异情况，为接下来人们的深入研究与分析提供理论基础与技术帮助。
1 检验材料及检验方法
1.1 检验材料。检验材料来源于平时的日常工作中检材，包括12份牙刷、6份腐败尸体肋软骨、6份腐败尸体指甲、4份饮水瓶。
1.2 检验方法
数据应用SPSS 20.0软件分析，计量资料以表示，多组比较使用单因素分析，不同时间点相关指标采用重复测量方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
1.2.1 DNA提取：①牙刷、饮水瓶使用尖头棉签，用纯水沾湿，用力擦拭牙刷刷毛的根部和饮水瓶的瓶嘴位置，剪下棉签，用Chelex法和磁珠法各做DNA提取。②肋软骨清洗干净，切除腐败的肉，取肋软骨中间部分约0.2×0.5 cm，用Chelex法和磁珠法各做DNA提取。③腐败尸体指甲清洗干净，切除腐败的部分，刮去指甲正反两面的角质层和粘附物，剪成0.1×0.1 cm大小，取数片，用纯水清洗干净后，用Chelex法和磁珠法各做DNA提取。
Chelex法提取过程：检材中加入10% Chelex-100的混悬液200 μL，置于eppendorf恒温混匀仪上设置56℃恒温震荡孵育 30 min；剧烈振荡 5-10 sec，98℃加热 8 min；12000 r/min离心3 min，上清液用于PCR扩增。
2.1 检验结果。使用PowerPlex® 21 System人类荧光标记STR复合扩增检测试剂（Promega公司）进行复合PCR扩增，包 含 Amel、D3S1358、D1S1656、D6S1043、D13S317、Penta E、D16S539、D18S51、D2S1338、CSF1PO、Penta D、TH01、vWA、D21S11、D7S820、D5S818、TPOX、D8S1179、D12S391、D19S433、FGA 21个基因座。实验以检出21个基因座为理想结果，见表1。
2.2 结果讨论。磁珠法的大力发展可追溯到20世纪90年代，硅质膜磁珠是一类最早出现基于硅介质与核酸特异结合的原理而发展的产品，其可广泛应用于DNA及RNA的纯化提取。硅质膜二氧化硅磁珠具有超顺磁性内核和二氧化硅外壳，表面修饰大量的硅羟基。磁珠表面的硅羟基能够与溶液中的核酸通过氢键和静电作用发生特异性结合，在高盐条件下与核酸结合，而在低盐环境下被洗脱，这样就可以直接从复杂的生物体系中迅速分离核酸[1]。到当今纳米级别的磁珠发展已经多样化，表面性质互不相同，分离原理亦不相同。但基本上固态的球状材料组成并无太大差异，基础结构一般分为三层，最内层的核心是聚苯乙烯、第二层包裹着磁性物质（四氧化三铁），最外层表面是官能基团修饰的高分子材料所构成，其中官能基团行使与核酸结合的工作，提取、生物素捕获、片段筛选功能的不同，表面官能基团不同[2]。本次研究中，采用了ML-超微量磁珠法DNA提取试剂盒（长春市博坤生物科技有公司）。ML-超微量磁珠法应用下，特殊微纳复合结构、强DNA吸附能力与全自动化方案结合，在该提取条件下，低含量DNA（≤10 ng）回收效率超过了80%。
2 检验结果及讨论
磁珠法提取过程：检材中加入200 µL消化液和16 µL 10 mg/mL 蛋白酶K、5 µL DTT溶液，56℃振荡孵育1-1.5h。取出置于湘仪 H1650-W台式离心机中，以12000 r/min离心3 min。取上清液于另一离心管中，加入300 µL吸附液和15 µL磁珠悬浊液，室温吸附20 min，期间上下均匀摇匀＞10次，置于磁力架上磁吸1 min，弃上清液，保留磁珠沉淀物。加入300µL洗涤液，上下均匀摇匀，置于磁力架上磁吸1 min，弃上清液，保留磁珠沉淀物。加入450 µL乙醇清洗液，上下均匀摇匀，置于磁力架上磁吸1 min，弃上清液，保留磁珠沉淀物（此步骤进行两次）。留磁珠沉淀物，将离心管置于eppendorf恒温混匀仪上设置56℃恒温，不振荡，将乙醇残留液挥干。挥干后往离心管中加入20 µL去离子水，混匀，置于56℃恒温混匀仪上，不振荡，10 min后取出，混匀，置于磁力架上磁吸1 min，取上清液1 µL以备扩增。
表1 获得完整STR分型的检材数
方法 检出结果(检出数/检材总数)牙刷 腐败尸体肋软骨 腐败尸体指甲 饮水瓶Chelex法 2/12 6/6 2/6 2/4磁珠法 11/12 6/6 6/6 4/4
Chelex法提取腐败尸体指甲DNA
（获得部分STR分型）
磁珠法提取腐败尸体指甲DNA
（获得完整STR分型）
1.2.2 PCR 扩增与检测：使用 PowerPlex® 21 System 人类荧光标记STR复合扩增检测试剂（Promega公司）进行复合PCR扩增。用ABI3100遗传分析仪（ABI公司）进行毛细管电泳和基因型分析。
原料配方：白条鸭10只，盐1～1.5kg，一级酱油3.5kg，糖酱色20g、丁香10粒，黄酒0.5kg。
不同的生物检材受到腐败作用的影响有所不同，由此会形成不同的DNA降解情况[3]。为了避免这个情况，均是选择同一个检材，用两个不同的提取方法比较实验结果。本次实验结果显示，使用磁珠法对牙刷、腐败尸体肋软骨、腐败尸体指甲、饮水瓶几种检材进行DNA提取，获得完整STR分型的检材数占总检材数百分比分别为：91.7%、100%、100%、100%。而相同检材，使用Chelex法获得完整STR分型的百分比分别为：16.7%、100%、33.3%、50%。实验证明，腐败尸体肋软骨检材用磁珠法及Chelex法提取效果无明显差异，腐败尸体指甲、牙刷、饮水瓶检材用磁珠法提取较之Chelex法提取起到更好的效果。尤其是像牙刷这种微量检材，本次实验结果显示磁珠法获得完整STR分型百分比较Chelex法高75%，可见用Chelex法较难得到完整的STR分型的微量或腐败尸体检材，经过磁珠法处理后，基本上都可以检出完整且理想的STR分型[4]。
本次实验表明，磁珠法的应用可以充分保障微量检材和腐败尸体检材的DNA检验效果[5-9]，有效提高DNA浓度，充分减少实验过程中的杂质，减少扩增抑制剂的应用。
采用热裂解法对表1中15株菌进行基因组DNA提取。阴性对照用无菌蒸馏水代替模板。按照优化好的RF-LAMP反应体系进行扩增来验证该方法的特异性。
参考文献
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中图分类号：R927.1
文献标识码：A DOI：10.19613/j.cnki.1671-3141.2019.64.071
本文引用格式：陈纪科.磁珠法和Chelex法在微量或腐败检材DNA检验中的效果对比及探讨[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(64):107-108.
作者简介：陈纪科（1985-），男，广东省东莞市，汉，本科，研究方向：法医临床、法医物证司法鉴定。
标签：腐败论文; 微量论文; 尸体论文; 法医论文; 牙刷论文; 政治论文; 法律论文; 法学各部门论文; 法医学论文; 《世界最新医学信息文摘》2019年第64期论文; 广东正航司法鉴定所论文;