导读:本文包含了解聚酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:噬菌体,内酯,多相,诱导,丁二酸,微管,丁酸。
解聚酶论文文献综述
王娜[1]（2019）在《聚己内酯解聚酶PCLase对高分子聚酯生物酶解的研究》一文中研究指出传统塑料大量使用造成的环境污染问题日益严重,因此可降解塑料的开发及生物降解机理研究受到广泛关注。目前的报道多集中于单一材料的酶解研究,关于同种酶降解不同材料的研究还鲜有报道。本实验室前期从土壤中分离到一株对多种生物聚酯具有降解性能的菌株,并克隆表达了一种同时对聚己内酯(PCL)和聚丁二酸丁二醇酯(PBS)具有降解能力的解聚酶PCLase,本论文比较了该酶降解PCL和PBS两种底物时的异同,并且通过定点突变技术突变了PCLase活性口袋周围的六个具有大的侧链基团的氨基酸,探讨了这些氨基酸在与两种底物作用时所发挥的不同功能。具体研究结果如下:(1)PCLase对PCL和PBS底物降解特性的研究PCLase与PCL和PBS底物反应的最适反应温度均为50℃,在30℃~50℃范围内具有良好的热稳定性;PCLase与两种底物反应的最适pH值均为9.0,缓冲体系为Gly-NaOH缓冲液,在pH 6-13之间均有良好的pH稳定性。金属离子Ca~(2+)、Mg~(2+)促进PCLase的酶活性,Zn~(2+)、Co~(2+)抑制PCLase的酶活性;EDTA、PMSF、Tween-80及Triton-X100均对PCLase酶活有明显抑制作用;以PBS为底物时,酶反应过程更易受到影响;相比于PBS材料,PCL是PCLase的更优底物。PCL底物的酶解产物为羟基己酸单体和二聚体;PBS的酶解产物为丁二酸-丁二醇单体、单体—1,4--丁二酸、二聚体、二聚体—1,4--丁二酸、叁聚体、叁聚体—1,4--丁二酸,显示出PCLase以外切型水解酶机制剪切PCL和PBS的分子链,但剪切位点存在明显差别。(2)PCLase对PCL和PBS固相底物的降解过程研究以固相薄膜材料为底物时,PCLase对PCL的降解能力明显高于对PBS的降解能力,其降解率是PBS降解率的15倍以上。动力学及过程分析显示PCLase对PCL分子链的结合能力及催化效率较PBS更强;同时PCLase对PCL薄膜具有更高的吸附能力;另外,PCL薄膜在结晶度上低于PBS,其分子链的解离相对于PBS更加容易,这些因素共同作用使得PCL薄膜的酶解效率更高。(3)PCLase底物结合过程中关键氨基酸的功能研究根据PCLase的结构确定了6个可能与底物结合相关的氨基酸位点,构建了6个突变体Y172A、Y204A、Y225A、Y211A、F229A和P231A,检测了突变体酶对PBS和PCL的降解能力。结果显示Y211突变后对PBS、PCL乳化底物的结合能力及催化效率下降,F229、P231突变后对PBS乳化底物的结合能力变化不大,对PCL乳化底物的结合能力下降,催化效率均下降,说明这叁个氨基酸在分子链与酶的结合过程中起着辅助作用;而Y172、Y204和Y225叁个氨基酸突变后,酶对PCL乳化底物的结合能力和对PCL薄膜的降解率下降,但对PBS乳化底物的结合能力和对PBS薄膜的降解率上升,说明这叁个氨基酸在酶与PCL和PBS两种底物作用的过程中所发挥的功能是有差异的。对于PCL底物,这些氨基酸起到辅助分子链与酶活性中心结合的作用,而对于PBS底物,这些氨基酸可能形成了空间位阻,阻碍了分子链向酶活性中心的靠近。(本文来源于《东北师范大学》期刊2019-05-01）
王灿[2]（2019）在《肺炎克雷伯菌噬菌体解聚酶克隆表达及抗菌活性研究》一文中研究指出目的肺炎克雷伯菌是引起医院获得性感染的常见革兰氏阴性条件致病菌之一。自上世纪80年代随着耐药性肺炎克雷伯菌出现,多重耐药肺炎克雷伯菌造成的复杂感染治疗愈加困难。随着全耐药性肺炎克雷伯菌的报道不断增多,迫使我们寻求治疗耐药性肺炎克雷伯菌感染的新型治疗策略与方法。本研究以荚膜型KN1型菌株Kp409为宿主菌,成功分离并鉴定一株裂解性噬菌体IME321,并对其进行全基因组高通量测序及相关生物信息学分析。在体外克隆表达噬菌体解聚酶、明确其抗菌活性后,在小鼠感染模型中评估该解聚酶的治疗及预防效果。方法以临床分离的肺炎克雷伯菌Kp409为宿主菌,从解放军总医院第五医学中心南院区(原解放军307医院)未经处理污水中筛选噬菌体;利用双层平板培养法测定噬菌体IME321的滴度,同时绘制噬菌体的最佳感染复数及一步生长曲线;经透射电镜观察负染法处理的噬菌体形态;提取噬菌体核酸,利用Ilumina Miseq高通量测序平台对噬菌体IME321进行全基因组测序,并进行有关生物信息学分析。PCR扩增噬菌体IME321解聚酶基因ORF42,将目的基因克隆进pEasy-BluntE1Expression Vector表达载体后诱导表达解聚酶(命名为Dp42),SDS-PAGE验证表达目的蛋白条带大小与预期是否相符。采用点滴法验证融合性表达的活性,采用联合血清实验验证其体外杀菌活性。腹腔注射法建立肺炎克雷伯菌Kp409感染小鼠模型。感染剂量分别为2×10~7cfu和2×10~8cfu,预防组在细菌感染前6h时分别腹腔注射50μg Dp42,治疗组在细菌感染后0.5h腹腔注射50μg Dp42,观察小鼠存活率,判断解聚酶Dp42对感染小鼠模型的保护效果。结果成功分离出一株噬菌体。根据国际病毒分类委员会(ICTV)规则,将其命名为vB_KpnP_IME321(简称IME321)。电镜观察该噬菌体具有正二十面体的头部,直径约38 nm,尾部特别短,仅约13 nm,属于有尾噬菌体(Caudovirales)目,短尾噬菌体科(podoviridae),Kp32病毒属。经双层平板法测定其最佳感染复数为0.01;进一步绘制一步生长曲线,其潜伏期较短,约为3min,爆发期25min,最终裂解量平均为410pfu/个。全基因组测序表明,IME321大小为39906bp,DNA呈线性双链基因组,G+C含量为52.8%,核苷酸含量为25.4%A、24.9%C、27.9%G和21.8%T。进一步对基因组注释分析:IME321基因中预测到49个ORF,这些基因的大小在123~3966 bp之间,这些ORF共覆盖39170 bp。没有整合酶、毒性或tRNA基因。基于噬菌体末端酶大亚基的系统发育树进一步分析并与GenBank公布的肺炎克雷伯菌噬菌体序列比对,IME321与美国、中国台湾研究团队分离的5株噬菌体同源最高,在进化树内聚集。蛋白BLASTp分析表明,IME321基因序列中ORF42编码一个T7超家族的假定尾丝蛋白。将IME321(位于33394-35857)ORF42基因克隆到pEasy-Blunt E1Expression Vector表达载体后,经SDS-PAGE鉴定,该蛋白分子量大小约为100kDa,经点板验证,该蛋白具有噬菌体解聚酶活性,命名为Dp42。体外实验发现Dp42单独使用可以在噬菌斑周围形成透明晕环、破坏细菌表面的荚膜多糖。与血清杀菌实验相比,Dp42联合血清杀菌能力明显提高、杀菌数量增加10倍(p<0.05),表现出协同杀菌作用。采用Balb/c小鼠肺炎克雷伯菌腹腔感染模型评价Dp42的体内杀菌活性。肺炎克雷伯菌在体外与解聚酶Dp42孵育0.5h后注射于小鼠腹腔,不论是低剂量(2×10~7cfu)感染还是高剂量(10~8cfu)感染,小鼠的死亡率均明显降低(16.7%vs 100%,p<0.05;25%vs 100%,p<0.05;每组均为8只小鼠)。直接将未经解聚酶Dp42体外处理的肺炎克雷伯菌注射于小鼠腹腔复制感染模型,不论是低剂量感染(2×10~6cfu)还是高剂量感染(2×10~7cfu),亦或是预防性给药(2×10~7cfu和2×10~8cfu)(感染前6h)还是治疗性给药(感染后0.5h),解聚酶Dp42均具有明显的保护效果,实验动物的存活率均为100%(n=8,p<0.05)。结论1.本研究采用临床分离的肺炎克雷伯菌,通过医院污水成功分离出1株裂解性噬菌体(IME321),并完成了该噬菌体的生物学鉴定与基因组学分析。2.成功克隆表达了IME321的解聚酶(Dp42),体外验证了该酶的抑菌作用及其与血清的协同杀菌活性。3.在Balb/c小鼠肺炎克雷伯菌腹腔感染模型上系统评价了解聚酶(Dp42)对感染动物的保护效果。研究结果表明解聚酶(Dp42)具有明确的杀菌作用,对小鼠腹腔感染模型有明显的保护效果,值得进一步研究,为耐药细菌感染的防治提供新思路与新方法。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2019-03-01）
岳贤臣,苏婷婷,李萍,王战勇[3]（2018）在《腐皮镰孢聚丁二酸丁二酯解聚酶基因优化及在毕赤酵母中的表达》一文中研究指出聚丁二酸丁二酯是一种可替代传统塑料的生物降解塑料,有助于解决白色污染问题,但其在自然界中往往降解缓慢,获取高效降解微生物或解聚酶是使其快速有效降解的关键。通过构建重组毕赤酵母表达体系以实现腐皮镰孢聚丁二酸丁二酯解聚酶(FSC)的高效表达。根据毕赤酵母偏好密码子优化FSC的基因密码子,并导入毕赤酵母X33中实现其重组表达。进一步通过单因素实验优化了菌株的产酶条件。结果显示,优化后的FSC基因序列中的157个碱基发生改变,G+C含量由59.6%降低到48.3%,序列同源性为77.34%;构建的重组表达载体p PICZα-FSC转入毕赤酵母X33,结合抗性平板初筛、SDS-PAGE和Western bolt验证,以及摇瓶发酵酶活力测定获得了1株具有较高产酶能力的重组菌株L1;进一步确定其摇瓶发酵培养条件:培养基起始p H 6.0,摇床转速220 r/min,甲醇补加量1%,接种量8%,培养时间72 h,培养温度30℃,此优化条件下菌株发酵液酶活力可达110 U/mL。(本文来源于《微生物学杂志》期刊2018年04期）
李晓倩,王睿,顾川佳,徐梦莎,何平[4]（2017）在《噬菌体多糖解聚酶及其应用》一文中研究指出随着临床上广泛耐药菌株的检出率逐年升高,新型抗菌药物需求日益迫切。越来越多的研究者们将注意力集中到噬菌体治疗上,并在这个领域取得了较大的进展。大量的研究表明,一些噬菌体能够产生降解细菌胞外聚合物基质的多糖解聚酶,继而裂解并杀死宿主菌。该文综述了噬菌体多糖解聚酶的分类和作用方式,判断噬菌体是否产生解聚酶的方法,以及该酶在治疗细菌性感染、降解生物膜和细菌荚膜分型上的应用。(本文来源于《上海交通大学学报(医学版)》期刊2017年12期）
郭志敏[5]（2017）在《一株大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_ECOO78的分离、鉴定和基因组学分析及其解聚酶Dpo42的作用机制》一文中研究指出因组学分析及其解聚酶Dpo42的作用机制大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是医院内最常见的条件致病菌之一,可引起多种局部和全身性的感染性疾病,并且大肠杆菌是最容易形成生物被膜的细菌之一,生物被膜的形成是大肠杆菌耐药性的一个重要原因。随着生物医学材料在临床上的广泛应用,如气管插管、人工心脏瓣膜、人工关节、动静脉导管、导尿管等,使相关感染发生率增高,据研究表明约有65%的人类感染疾病与生物被膜的形成有关,90%的机械通气患者气管插管处有细菌定植导致反复感染,导尿管相关的泌尿系统感染发生率为9.23%,况且被膜菌的耐药性是浮游菌的1000多倍,因此给临床的治疗带来了极大的困难。噬菌体(bacteriophage)是一类能专一性感染其宿主菌的病毒,宿主菌可以是细菌、真菌、放线菌或螺旋菌等微生物,利用宿主菌的复制合成自身成分并组装,通过破坏宿主菌来释放子代噬菌体,有些噬菌体可以通过编码的解聚酶来水解细菌形成的生物被膜,所以噬菌体在应对细菌感染性疾病方面具有重要的潜力。本研究拟以大肠杆菌噬菌体及其解聚酶作为研究对象,探索大肠杆菌噬菌体解聚酶作为治疗制剂的潜力及其抗生物被膜作用的机制。首先以大肠杆菌O78-3作为宿主菌,对其特异性噬菌体进行了分离、筛选和纯化,最终得到了一株具有抗生物被膜活性的烈性噬菌体,命名为vB_EcoM_ECOO78,能够裂解5株大肠杆菌临床分离株,最佳MOI为10~(-5),裂解量为74 PFU/infection,通过透射电子显微镜观察,该噬菌体具有典型的二十面体头部和伸缩性的尾部,全长149±3nm,头部47±2nm,根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of viruses,ICTV)的最新分类方法该噬菌体属于有尾病毒目(Caudovirales),肌尾噬菌体科(Myoviridae)。对噬菌体vB_EcoM_ECOO78的全基因组进行了序列测定及比对分析,结果表明该噬菌体全长为41,289 bp,共具有56个开放式阅读框(ORF),G+C%为53.07%,其中51(91.07%)个ORF具有假定功能,51个CDS编码的蛋白大小从6.28 kDa(ORF16)到86.39 kDa(ORF10)。有46(90.2%)个起始密码子为ATG,4个(7.8%)起始密码子为GTG,只有1个起始密码子为TTG;27(52.9%)个终止密码子为TGA,22个(43.1%)终止密码子为TAA,2个(3.57%)终止密码子为TAG。比对分析表明vB_EcoM_ECOO78与vB_EcoM-ep3,vB_EcoM_ECO1230-10,Enterobacter phage Arya,Pseudomonas phage PPpW-3和vB_EcoM_CBA120亲缘关系较近,但是vB_EcoM_ECOO78基因组还存在自己特有的一部分序列,例如487-745 bp,8044-8331 bp,15921-16054 bp,16295-16630 bp,16725-16898 bp,16937-17288 bp,18514-18826 bp,32937-33581bp是上述5株噬菌体的基因组所没有的。因此推测vB_EcoM_ECOO78基因组上特有的这些序列是导致其不同于上述5株噬菌体的原因。另外,通过比对还发现噬菌体vB_EcoM_ECOO78不仅与其他噬菌体,而且与大肠杆菌和叶缘焦枯病菌之间存在着基因的交换或转移。综合以上的一般生物学特性和测序结果判断vB_EcoM_ECOO78为烈性噬菌体:vB_EcoM_ECOO78裂解宿主菌O78-3形成的噬菌斑透明,边缘清晰;从一步生长曲线中可观察到vB_EcoM_ECOO78裂解宿主菌O78-3后释放了较多的子代的噬菌体;对该噬菌体进行的全基因组序列测定后,与数据库中的噬菌体基因组进行比对和分析,没有发现整合酶基因或者免疫阻遏相关基因。vB_EcoM_ECOO78形成的噬菌斑周围有晕圈的存在说明该噬菌体可能编码解聚酶,对vB_EcoM_ECOO78基因组序列的进一步进行分析确定了vB_EcoM_ECOO78的解聚酶基因(ORF42),并对其解聚酶Dpo42进行了表达和纯化,Dpo42在大肠杆菌BL21中可溶性表达。解聚酶Dpo42由747个氨基酸组成,一共有9个α螺旋,55个β折叠,等电点为4.77,分子量为78.58 KDa,解聚酶Dpo42的进化关系分析显示Dpo42处于独立的一个分支上,与其他10个解聚酶的亲缘关系相对较远。经过纯化并浓缩的Dpo42具有抗宿主菌(大肠杆菌O78-3)生物被膜的活性,并且随着培养时间的延长,斑点会逐渐增大,并且Dpo42浓度的越大,斑点越大,说明Dpo42的抗宿主菌生物被膜的活性具有浓度依赖性。利用96孔板的方法来筛选大肠杆菌生物被膜形成的能力和检测Dpo42的活性,Dpo42能够明显抑制2株大肠杆菌强生物被膜的形成,通过Maneval染色,Dpo42能够降解大肠杆菌的荚膜多糖,综上,Dpo42是一种新的噬菌体来源的解聚酶,是抑制大肠杆菌生物被膜形成的新策略。(本文来源于《吉林大学》期刊2017-10-01）
董莹[6]（2017）在《聚丁二酸丁二醇酯解聚酶的分离纯化及其酶学性质研究》一文中研究指出聚丁二酸丁二醇酯(PBS)是目前世界公认的综合性能最好的生物可降解塑料。相比较其他生物可降解材料,PBS具有成本低,性能好,能非常好的和其他材料进行有效聚合,同时其性能介于聚乙烯和聚丙烯之间,因此其工业应用前景非常广泛,具有很好的市场与经济价值。本论文利用实验室保存的能够降解PBS的Pseudomonas sp.DS1001,采用单因素实验和正交试验对菌株的发酵条件进行了优化。同时对Pseudomonas sp.DS1001菌株分泌的解聚酶进行了分离纯化,研究了PBS解聚酶的酶学性质和酶学属性,最终得到以下结论:(1)单因素条件优化结果为:含碳量为0.2%,装液量为150m L/250m L,培养时72h,培养基初始p H为9.0;根据正交试验,Pseudomonas sp.DS1001的最佳产酶条件为:37℃、培养基初始p H 9.0、含碳量为0.25%和装液量为150m L/250m L。酶活提高45%。(2)将发酵的粗酶液通过超滤、DEAE阴离子交换层析两步分离纯化,最终从菌株Pseudomonas sp.DS1001中得到一个分子量约为50KDa的胞外PBS解聚酶纯酶组分。PBS解聚酶的最适反应温度为50℃,在4~50℃以内均具有很好的热稳定性;PBS解聚酶的最适反应p H为8.0(Na2HPO4-Na H2PO4缓冲液),在p H4.0~10.0范围内,PBS解聚酶的剩余酶活力达到50%以上;金属离子对PBS解聚酶有重要影响。此外,EDTA、PMSF能强烈的抑制PBS解聚酶活力;PBS解聚酶对有机溶剂有一定的耐受性,但Triton X-100,无论是低浓度还是高浓度均能抑制PBS解聚酶。(3)通过肽质谱分析得知到从Pseudomonas sp.DS1001纯化的PBS解聚酶是一种脂肪酶。纯化的PBS解聚酶对PBS、PHB及PCL等脂肪族聚酯具有一定的降解活性,而不能降解PLA。PBS解聚酶对p-NPC4的催化效果最好。对降解后PBS膜片利用扫描电镜观察,实验结果显示,在PBS解聚酶作用之前PBS膜片表面相对光滑平整,但是在PBS解聚酶的作用下,PBS膜片表面出现明显的蜂窝状孔洞,同时随着降解时间的延长PBS膜片表面孔洞明显变大变深。质谱分析PBS解聚酶降解产物降解产物为丁二酸、丁二酸-丁二醇、丁二酸-丁二醇-丁二酸、丁二酸-丁二醇-丁二酸-丁二醇。(本文来源于《东北师范大学》期刊2017-05-01）
王岩[7]（2017）在《菌株DSWY01的多相分类鉴定及其PHB解聚酶结构域功能的探究》一文中研究指出在前期研究中,本实验室分离筛选出了一株能够降解聚-3-羟基丁酸酯(PHB)的细菌菌株DSWY01,除了能够高效降解PHB以外,该菌株对其他多种聚合物如聚乳酸(PLA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)及聚ε-己内酯(PCL)等也具有降解作用,是研究及评估高分子聚合物生物降解机制与特性的极佳材料。前期的研究工作显示该菌株属于假单胞菌属,但其理化特性与属内其它种的标准菌株存在显着不同。因此本文采用多相分类鉴定的方法对菌株DSWY01进行了系统的菌种鉴定,确定该菌株为假单胞菌的一个新种,并将其命名为Pseudomonas changchunensis。同时,本论文还研究了菌株DSWY01的PHB解聚酶的结构域,确定了各结构域的基本功能以及其在PHB材料降解中的重要作用。具体研究结果如下:1.从表型、化学组分及遗传特征叁个方面对菌株进行了系统鉴定,结果显示菌株DSWY01为革兰氏阴性菌,短杆状,无芽孢和荚膜,有单一的端生鞭毛。单菌落为圆形,黄白色,表面光滑且湿润,中间微凸且颜色比周围深。菌株在4°C时不生长,41°C时能够生长,最适生长温度是37°C;最适pH是7.0;大于4%的NaCl会抑制其生长。菌株在碳源氮源利用、糖醇发酵及酶反应方面与参比的标准菌株存在显着差异。DSWY01主要的细胞壁脂肪酸有11种,C18:1ω7c/C18:1ω6c与C16:0为其中含量最多的两种,分别约占总量的36.91%和19.55%。基于16S rDNA的系统发育分析结果显示该菌株与P.mendocina,P.alcaliphila,P.oleovorans在亲缘关系上最为接近,但其它遗传特征方面具有明显差异,菌株DSWY01全基因组DNA(G+C)含量约为63.65%(Tm),与P.mendocina,P.alcaliphila,P.oleovorans标准菌株的DNA杂交率分别为44.24%,21.62%和41.92%。最终根据多相分类鉴定所得结果,确定菌株DSWY01为Pseudomonas属的一个新种,命名为Pseudomonas changchunensis。2.对菌株DSWY01的PHB解聚酶基因序列进行了分析,预测了其可能的功能结构域,包括一个催化结构域(CD),一个连接区(LD),以及两个底物结合结构域(SBDI和SBDII)。本研究通过对菌株DSWY01 PHB解聚酶基因进行截短突变获得了含有不同结构域的重组突变体;通过优化诱导表达最终获得了五种重组酶;并进一步对重组酶进行了降解及吸附性能的检测,以探究PHB解聚酶各个结构域的功能,结果显示:(1)只含有催化域CD的重组酶con具有对p-NP6水溶性底物的降解能力,但对PHB乳化底物的降解大大减弱,仅为野生型重组酶的1/5;且重组酶丧失了PHB膜片降解能力,对PHB粉末的吸附率约为22%。(2)含有催化域CD和连接区LD的重组酶link对p-NP6水溶性底物具有降解能力;对PHB乳化底物的降解活性约为重组酶S1+2的1/3;重组酶link不能够降解PHB膜片,,对PHB粉末的吸附率约为35%。(3)含有CD、LD和一个底物结合域SBDI的重组酶S1及含有CD、LD和另一个底物结合域SBDII的重组酶S2对p-NP6水溶性底物具有降解能力;对PHB乳化底物的降解活性约为重组酶S1+2的1/2;低浓度下重组酶S1和S2均不能降解PHB膜片;重组酶S1与S2的吸附能力相差不大,吸附率约为80%。(4)同时含有CD、LD和两个底物结合域的野生型重组酶S1+2对p-NP6水溶性底物具有降解能力;重组酶S1+2对PHB乳化底物的降解能力最强,对PHB粉末的吸附能力也最强,几乎达到100%;此外在浓度较低的情况下,只有含有两个底物结合域的重组酶S1+2能够降解PHB膜片。上述结果表明,解聚酶中催化结构域CD为独立完整的酯酶催化结构域,具有水解酯类底物的功能,但解聚酶对PHB固相材料的降解需要底物结合结构域的参与。另一方面,单一的底物结合结构域SBDI和SBDII具有对固相材料的吸附能力,但对PHB薄膜的降解作用依然较弱,而同时具有两个底物结合结构域的重组酶则显示了更高的吸附性以及高效的PHB降解能力,该结果证实了底物结合结构域对于酶吸附固相底物是必需的,是固相聚酯酶解的前提条件;但同时也显示出,底物结合结构域除了完成对底物的吸附功能以外,可能还在维持酶的稳定性及构象方面具有重要作用。(本文来源于《东北师范大学》期刊2017-05-01）
包剑锋[8]（2017）在《来源于Pseudomonas sp.DS1001的聚己内酯解聚酶的分离纯化和酶学性质研究》一文中研究指出聚己内酯(PCL)是由ε-己内酯聚合而成的高分子聚酯材料,能够在自然界中被微生物分泌的解聚酶完全降解。本实验室在前期研究中筛选了一株对PCL具有高效降解作用的菌株Pseudomonas sp.DS1001,该菌株能够产生多种对PCL具有降解作用的解聚酶。实验室前期已获得一种分子量为28.4kDa的PCL解聚酶I。本研究通过重新对该菌的发酵液进行分离纯化,优化了PCL解聚酶I的纯化流程,并获得了与PCL解聚酶I具有明显差别的PCL解聚酶Ⅱ,对其酶学性质进行了检测,对该酶的基因进行了克隆和序列分析,同时探讨了该酶对PCL的降解过程,为更好地阐述PCL的降解机制奠定了基础,具体研究内容及结果如下。(1)通过离子交换柱层析和分子筛层析纯化得到了PCL解聚酶I和PCL解聚酶Ⅱ,其中,PCL解聚酶I的纯化倍数为5.02,回收率为18.69%,PCL解聚酶Ⅱ的纯化倍数为4.01,回收率为12.93%。对PCL解聚酶Ⅱ的SDS-PAGE检测显示其分子量大小约为32.79kDa。(2)对PCL解聚酶Ⅱ的酶学性质进行了研究,结果显示该酶的最适反应温度为40℃,在20℃-60℃的范围内温度稳定性良好;该酶的最适反应pH为10.0,在pH6.0-12.0的范围内具有较好的稳定性;金属离子对酶活性具有不同程度的影响,在金属离子浓度为1mM时,Zn2+离子能够抑制酶活性,Mg2+、Na+、Ca2+以及Co2+等离子能够不同程度的提高酶活性;EDTA和PMSF对酶活性具有明显的抑制作用;Triton X-100和Tween-80强烈抑制酶活性;该酶对甲醇、乙醇和甘油等有机溶剂的耐受性良好。(3)对PCL解聚酶Ⅱ的底物特异性进行了研究,结果表明该酶对脂肪族聚酯PBS、PHB及叁丁酸甘油酯和不同碳链长度的pNP酯均具有降解活性;但对PLA和苹果皮粗角质无降解活性;分别以叁丁酸甘油酯和pNPC6为底物,能够检测到PCL解聚酶Ⅱ的脂肪酶“界面激活”效应。(4)对PCL解聚酶Ⅱ的基因进行了克隆,并在E.coli BL21中实现了异源表达。利用预测软件对重组酶Pclase Ⅱ的理化性质和结构进行了分析,结果显示,Pclase Ⅱ由317个氨基酸构成,理论分子量为33.1994kDa,理论等电点为6.59;其N端可能含有一个由25个氨基酸残基组成的信号肽序列,30-316位氨基酸具有α/β水解酶家族的保守序列;与其氨基酸序列相似性较高的蛋白多来源于Pseudomonas sp.的脂肪酶;二级结构中,无规则卷曲占53.94%,α-螺旋和β-折迭分别占36.90%和9.14%;以Pseudomonas aeruginosa PAO1的脂肪酶的PAL(1ex9.1.A)为模板进行了叁维模建,推测Pclase Ⅱ叁维结构中存在一个与其“界面激活”效应相关的可移动的α-螺旋“盖子结构”。(5)对PCL解聚酶Ⅱ的降解PCL的机制进行研究,实验结果表明,其对PCL乳化底物的降解终产物为羟基己内酯单体、二聚体、叁聚体和四聚体,在不完全降解阶段,还存在五聚体和六聚体。PCL膜片降解速率呈现先慢后快的趋势;SEM结果显示,随着酶解作用的进行,PCL的非结晶区优先降解,之后为球状结晶区,球晶的降解从中心开始,并逐渐向外周扩展。(本文来源于《东北师范大学》期刊2017-05-01）
齐晶[9]（2016）在《聚己内酯解聚酶催化ε-己内酯开环聚合的研究》一文中研究指出聚(ε-己内酯)(poly(ε-caprolactone),PCL)是由ε-己内酯开环聚合而成的一种脂肪族聚酯,在包装材料、医药产品、环保工程等领域具有广泛的应用。目前PCL的合成方法主要有化学合成法和生物酶促合成法。其中,化学合成方法需要在高温下(150-280℃)进行反应,使用的金属催化剂具有毒性且选择性不高,这些缺点限制了PCL的合成生产及在某些特殊领域的应用。相比而言,生物酶促合成法则利用了生物酶的催化作用,反应条件温和,且避免了金属离子的引入,同时通过控制酶的结构可以选择性的进行保护和脱保护,显现出生物催化作用的独特优势,成为近年来高分子合成方面的研究热点。本文以两种属性分别为脂肪酶和角质酶的PCL解聚酶为研究对象,对其在非水相介质中逆向催化聚酯合成的能力进行了探讨,并进一步对两种酶催化ε-己内酯开环聚合的工艺及动力学进行了系统的研究,具体结果如下:(1)脂肪酶属性的PCLase0801和角质酶属性的PCLase1001在有机相中均能够催化不同链长的二酸和二醇之间的缩聚反应以及ε-己内酯和δ-戊内酯的开环聚合反应,证明两种解聚酶具有逆向催化合成聚酯的能力。(2)PCLase0801催化ε-己内酯开环聚合反应的最佳体系为100 mg酶粉、45℃、8 h、正己烷溶剂、0.11 aw,产物数均分子量(Mn)为6,050 g/mol,重均分子量(Mw)为11,074 g/mol,多分散度(PDI)为1.7024,分子量分布均一。PCLase1001催化ε-己内酯开环聚合反应的最佳体系为100 mg酶粉、45℃、8 h、无溶剂、0.11aw,产物Mn为4,326 g/mol,Mw为5,899 g/mol,PDI为1.3636,分子量分布均一。(3)利用1H NMR、FT-IR、GPC、DSC、TGA及偏振光显微观察对聚合产物的性质进行了表征,结果表明,PCLase0801和PCLase1001酶促聚合产物结晶度分别为84%和79%,具有良好的热稳定性、流动性和渗透性,在药物输送载体方面具有应用潜力。(4)Michaelis-Menten动力学分析表明,PCLase0801和PCLase1001的Vmax分别为9.25 mg/h、11.53 mg/h,Km分别为4.21 mol/L、2.44 mol/L,PCLase1001底物与酶的结合能力强于PCLase0801。(5)Amberlite XAD1180N大孔吸附树脂固定化载体对PCLase0801和PCLase1001的吸附率分别为81%和100%,固定化酶在第二、叁次使用时酶活分别保留初始酶活的79.87%、63.52%和98.10%和70.25%,与游离酶相比,提高了酶的重复利用率。本文对两种PCL解聚酶的逆向合成聚酯能力进行了研究,与固定化技术相结合,在实验室水平上建立酶法催化PCL合成的技术路线,为其在工业生产方面的应用奠定了基础。(本文来源于《东北师范大学》期刊2016-05-01）
周浩,沈涛[10]（2014）在《微管解聚酶驱动蛋白家族成员KIF2A研究进展》一文中研究指出驱动蛋白家族成员2A(KIF2A)是一种能够与微管相互作用的蛋白,它参与了细胞内物质运输、细胞迁移、细胞形态改变,以及有丝分裂细胞纺锤体动力学等重要的细胞活动。近年来研究发现,KIF2A凭借其独特的微管解聚能力,对神经元中神经突的生长以及细胞有丝分裂中染色体的运动起着重要的调节作用。将主要对KIF2A在脊椎动物神经元发育和细胞有丝分裂中所行使的作用和功能进行综述。(本文来源于《生命科学》期刊2014年08期）
解聚酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的肺炎克雷伯菌是引起医院获得性感染的常见革兰氏阴性条件致病菌之一。自上世纪80年代随着耐药性肺炎克雷伯菌出现,多重耐药肺炎克雷伯菌造成的复杂感染治疗愈加困难。随着全耐药性肺炎克雷伯菌的报道不断增多,迫使我们寻求治疗耐药性肺炎克雷伯菌感染的新型治疗策略与方法。本研究以荚膜型KN1型菌株Kp409为宿主菌,成功分离并鉴定一株裂解性噬菌体IME321,并对其进行全基因组高通量测序及相关生物信息学分析。在体外克隆表达噬菌体解聚酶、明确其抗菌活性后,在小鼠感染模型中评估该解聚酶的治疗及预防效果。方法以临床分离的肺炎克雷伯菌Kp409为宿主菌,从解放军总医院第五医学中心南院区(原解放军307医院)未经处理污水中筛选噬菌体;利用双层平板培养法测定噬菌体IME321的滴度,同时绘制噬菌体的最佳感染复数及一步生长曲线;经透射电镜观察负染法处理的噬菌体形态;提取噬菌体核酸,利用Ilumina Miseq高通量测序平台对噬菌体IME321进行全基因组测序,并进行有关生物信息学分析。PCR扩增噬菌体IME321解聚酶基因ORF42,将目的基因克隆进pEasy-BluntE1Expression Vector表达载体后诱导表达解聚酶(命名为Dp42),SDS-PAGE验证表达目的蛋白条带大小与预期是否相符。采用点滴法验证融合性表达的活性,采用联合血清实验验证其体外杀菌活性。腹腔注射法建立肺炎克雷伯菌Kp409感染小鼠模型。感染剂量分别为2×10~7cfu和2×10~8cfu,预防组在细菌感染前6h时分别腹腔注射50μg Dp42,治疗组在细菌感染后0.5h腹腔注射50μg Dp42,观察小鼠存活率,判断解聚酶Dp42对感染小鼠模型的保护效果。结果成功分离出一株噬菌体。根据国际病毒分类委员会(ICTV)规则,将其命名为vB_KpnP_IME321(简称IME321)。电镜观察该噬菌体具有正二十面体的头部,直径约38 nm,尾部特别短,仅约13 nm,属于有尾噬菌体(Caudovirales)目,短尾噬菌体科(podoviridae),Kp32病毒属。经双层平板法测定其最佳感染复数为0.01;进一步绘制一步生长曲线,其潜伏期较短,约为3min,爆发期25min,最终裂解量平均为410pfu/个。全基因组测序表明,IME321大小为39906bp,DNA呈线性双链基因组,G+C含量为52.8%,核苷酸含量为25.4%A、24.9%C、27.9%G和21.8%T。进一步对基因组注释分析:IME321基因中预测到49个ORF,这些基因的大小在123~3966 bp之间,这些ORF共覆盖39170 bp。没有整合酶、毒性或tRNA基因。基于噬菌体末端酶大亚基的系统发育树进一步分析并与GenBank公布的肺炎克雷伯菌噬菌体序列比对,IME321与美国、中国台湾研究团队分离的5株噬菌体同源最高,在进化树内聚集。蛋白BLASTp分析表明,IME321基因序列中ORF42编码一个T7超家族的假定尾丝蛋白。将IME321(位于33394-35857)ORF42基因克隆到pEasy-Blunt E1Expression Vector表达载体后,经SDS-PAGE鉴定,该蛋白分子量大小约为100kDa,经点板验证,该蛋白具有噬菌体解聚酶活性,命名为Dp42。体外实验发现Dp42单独使用可以在噬菌斑周围形成透明晕环、破坏细菌表面的荚膜多糖。与血清杀菌实验相比,Dp42联合血清杀菌能力明显提高、杀菌数量增加10倍(p<0.05),表现出协同杀菌作用。采用Balb/c小鼠肺炎克雷伯菌腹腔感染模型评价Dp42的体内杀菌活性。肺炎克雷伯菌在体外与解聚酶Dp42孵育0.5h后注射于小鼠腹腔,不论是低剂量(2×10~7cfu)感染还是高剂量(10~8cfu)感染,小鼠的死亡率均明显降低(16.7%vs 100%,p<0.05;25%vs 100%,p<0.05;每组均为8只小鼠)。直接将未经解聚酶Dp42体外处理的肺炎克雷伯菌注射于小鼠腹腔复制感染模型,不论是低剂量感染(2×10~6cfu)还是高剂量感染(2×10~7cfu),亦或是预防性给药(2×10~7cfu和2×10~8cfu)(感染前6h)还是治疗性给药(感染后0.5h),解聚酶Dp42均具有明显的保护效果,实验动物的存活率均为100%(n=8,p<0.05)。结论1.本研究采用临床分离的肺炎克雷伯菌,通过医院污水成功分离出1株裂解性噬菌体(IME321),并完成了该噬菌体的生物学鉴定与基因组学分析。2.成功克隆表达了IME321的解聚酶(Dp42),体外验证了该酶的抑菌作用及其与血清的协同杀菌活性。3.在Balb/c小鼠肺炎克雷伯菌腹腔感染模型上系统评价了解聚酶(Dp42)对感染动物的保护效果。研究结果表明解聚酶(Dp42)具有明确的杀菌作用,对小鼠腹腔感染模型有明显的保护效果,值得进一步研究,为耐药细菌感染的防治提供新思路与新方法。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
解聚酶论文参考文献
[1].王娜.聚己内酯解聚酶PCLase对高分子聚酯生物酶解的研究[D].东北师范大学.2019
[2].王灿.肺炎克雷伯菌噬菌体解聚酶克隆表达及抗菌活性研究[D].安徽医科大学.2019
[3].岳贤臣,苏婷婷,李萍,王战勇.腐皮镰孢聚丁二酸丁二酯解聚酶基因优化及在毕赤酵母中的表达[J].微生物学杂志.2018
[4].李晓倩,王睿,顾川佳,徐梦莎,何平.噬菌体多糖解聚酶及其应用[J].上海交通大学学报(医学版).2017
[5].郭志敏.一株大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_ECOO78的分离、鉴定和基因组学分析及其解聚酶Dpo42的作用机制[D].吉林大学.2017
[6].董莹.聚丁二酸丁二醇酯解聚酶的分离纯化及其酶学性质研究[D].东北师范大学.2017
[7].王岩.菌株DSWY01的多相分类鉴定及其PHB解聚酶结构域功能的探究[D].东北师范大学.2017
[8].包剑锋.来源于Pseudomonassp.DS1001的聚己内酯解聚酶的分离纯化和酶学性质研究[D].东北师范大学.2017
[9].齐晶.聚己内酯解聚酶催化ε-己内酯开环聚合的研究[D].东北师范大学.2016
[10].周浩,沈涛.微管解聚酶驱动蛋白家族成员KIF2A研究进展[J].生命科学.2014
论文知识图
