金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15及其功能域的酶学性质及在牛奶体系中的活力

论文摘要

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）广泛存在于自然环境中,是乳制品生产过程中需要严格控制的一种食源性致病菌。本文以金黄色葡萄球菌噬菌体GH15在增殖后期产生的能专一性裂解金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖的裂解酶LysGH15为研究对象,对其酶学性质进行了研究,且在牛奶体系中进行了活力测定。为了进一步了解LysGH15在牛奶体系中杀菌时的状态,单独表达了裂解酶LysGH15的结合域SH3b和裂解域CHAP,研究了两者的酶学性质,同时探讨了它们在牛奶中应用的潜力。主要研究结果如下:（1）LysGH15在缓冲液体系中有着很强的裂解金黄色葡萄球菌的能力,最适反应温度为3035oC,最适pH为6。浓度为0.4 mg/mL的LysGH15能在5 min内将金黄色葡萄球菌重悬液的OD600nm从1.2下降到0.2,具有很好的应用前景。但是其热稳定性不佳,60oC时半衰期小于30 s,不适宜直接应用于需高温加热的食品中。同时在牛奶模拟体系中的研究发现,牛奶体系中大部分组成都不利于LysGH15发挥裂解活力,尤其是高脂肪和低盐环境。在纯牛奶加入250 mM NaCl能使LysGH15的活力得到提高,在脱脂奶中的提高效果更为明显。（2）为了解LysGH15在牛奶体系中杀菌时的状态,从而解释LysGH15在牛奶体系中裂解金黄色葡萄球菌所受到的阻碍,将绿色荧光蛋白（EGFP）和LysGH15结合域SH3b的融合表达后,以荧光强度为指标,对结合域SH3b识别金黄色葡萄球菌的性质进行了研究。EGFP-SH3b的最适温度为30oC,最适pH为4。在缓冲液体系中,当NaCl浓度为0时,EGFP-SH3b仍有较强的结合能力。当NaCl浓度为100 mM400 mM时结合能力最强。牛奶体系中,若不额外添加NaCl,EGFP-SH3b与金黄色葡萄球菌的结合能力较弱,而添加了500 mM NaCl后,则表现出和缓冲体系中相近的结合能力。由此说明LysGH15之所以在低盐环境中无法裂解金黄色葡萄球菌,是因为在低盐的环境中牛奶的一些组分阻碍了其结合域SH3b与金黄色葡萄球菌的结合,同时NaCl的存在能消除这部分阻碍。（3）由于LysGH15的性质不适合在牛奶体系中进行杀菌,而大多数噬菌体裂解酶的裂解域存在的一定的裂解活力,所以对LysGH15的裂解域CHAP在牛奶体系中的杀菌效果进行了研究。裂解域CHAP的最适表达条件如下:OD600nm为0.6时加入IPTG至0.6 mM,26oC诱导6 h。CHAP的最适反应温度为30oC,最适pH为68。当缓冲液中NaCl浓度为0时,CHAP的活力最高。随着NaCl浓度的升高,CHAP的酶活下降。CHAP在牛奶体系中的杀菌效果一方面受到自身活力的限制,另一方面也受到了金黄色葡萄球菌增殖速率快的影响。在0oC下,向牛奶中添加1.0 mg/mL的CHAP能在8 h内使金黄色葡萄球菌的数量下降1.5个对数。CHAP在不同的市售奶制品中都表现出了明显的杀菌活力,其中以早餐奶效果最佳,在8 h内使菌落总数下降了3个对数。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中英文缩略语对照表
• 第一章 绪论
•   1.1 金黄色葡萄球菌简介
•     1.1.1 金黄色葡萄球菌的生物学特性
•     1.1.2 金黄色葡萄球菌食物中毒的原理
•     1.1.3 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在食品链中的传播
•   1.2 噬菌体概述
•     1.2.1 噬菌体的杀菌特性
•     1.2.2 噬菌体应用的优势与劣势
•   1.3 噬菌体裂解酶的研究进展
•     1.3.1 噬菌体裂解酶的作用机理
•     1.3.2 噬菌体裂解酶的酶学性质
•     1.3.3 噬菌体裂解酶裂解域的酶学性质
•     1.3.4 噬菌体裂解酶结合域的酶学性质
•     1.3.5 噬菌体裂解酶的相关应用
•   1.4 立题背景与研究意义
•   1.5 主要研究内容
• 第二章 金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15 的酶学性质及其在牛奶体系中的活力
•   2.1 前言
•   2.2 实验材料与设备
•     2.2.1 材料与试剂
•     2.2.2 试剂配制
•     2.2.3 主要仪器设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 重组质粒pET15b-LysGH15 的验证
•     2.3.2 重组质粒pET15b-LysGH15 的转化
•     2.3.3 LysGH15 的诱导表达
•     2.3.4 金黄色葡萄球菌菌悬液的制备
•     2.3.5 LysGH15 酶活的测定
•     2.3.6 LysGH15 的分离纯化
•     2.3.7 LysGH15 的最适反应温度
•     2.3.8 LysGH15 的最适反应pH
•     2.3.9 LysGH15 的热稳定性
•     2.3.10 金属离子浓度对LysGH15 活力的影响
•     2.3.11 NaCl浓度对LysGH15 活力的影响
•     2.3.12 LysGH15 对不同耐药金黄色葡萄球菌的裂解活力
•     2.3.13 牛奶组分对LysGH15 活力的影响
•     2.3.14 LysGH15 在牛奶中的应用
•     2.3.15 数据分析
•   2.4 实验结果与讨论
•     2.4.1 重组质粒pET15b-LysGH15在BL21（DE3）中的表达验证
•     2.4.2 LysGH15 的分离纯化
•     2.4.3 LysGH15 的酶学性质
•     2.4.4 牛奶组分对LysGH15 活力的影响
•     2.4.5 LysGH15 在牛奶体系中的活力
•   2.5 本章小结
• 第三章 金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15 结合域SH3b对金黄色葡萄球菌的结合特性
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料与设备
•     3.2.1 材料与试剂
•     3.2.2 主要仪器设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 增强绿色荧光蛋白EGFP-SH3b的原核表达
•     3.3.2 融合蛋白EGFP-SH3b的表达
•     3.3.3 融合蛋白EGFP-SH3b与金黄色葡萄球菌的结合情况
•     3.3.4 温度对融合蛋白EGFP-SH3b与金黄色葡萄球菌结合的影响
•     3.3.5 pH对融合蛋白EGFP-SH3b与金黄色葡萄球菌结合的影响
•     3.3.6 NaCl对融合蛋白EGFP-SH3b与金黄色葡萄球菌结合的影响
•     3.3.7 融合蛋白EGFP-SH3b在牛奶中与金黄色葡萄球菌的结合情况
•     3.3.8 数据分析
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 EGFP的表达与纯化
•     3.4.2 EGFP-SH3b的表达与纯化
•     3.4.3 融合蛋白EGFP-SH3b与金黄色葡萄球菌的结合情况
•     3.4.4 温度对融合蛋白EGFP-SH3b与金黄色葡萄球菌结合的影响
•     3.4.5 pH对融合蛋白EGFP-SH3b与金黄色葡萄球菌结合的影响
•     3.4.6 NaCl对融合蛋白EGFP-SH3b与金黄色葡萄球菌结合的影响
•     3.4.7 融合蛋白EGFP-SH3b在牛奶体系中与金黄色葡萄球菌的结合情况
•   3.5 本章小结
• 第四章 金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15 裂解域CHAP的酶学性质及其在牛奶体系中的活力
•   4.1 前言
•   4.2 实验材料与设备
•     4.2.1 材料与试剂
•     4.2.2 主要仪器设备
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 重组质粒pET28a-CHAP的构建
•     4.3.2 裂解域CHAP的表达条件优化
•     4.3.3 裂解域CHAP的分离纯化
•     4.3.4 裂解域CHAP酶活的测定
•     4.3.5 裂解域CHAP的酶学性质
•     4.3.6 裂解域CHAP在牛奶体系中的活力
•     4.3.7 数据分析
•   4.4 实验结果与讨论
•     4.4.1 重组质粒pET28a-CHAP的构建
•     4.4.2 裂解域CHAP的表达条件优化
•     4.4.3 裂解域CHAP的表达及纯化
•     4.4.4 裂解域CHAP的酶学性质
•     4.4.5 裂解域CHAP在牛奶体系中的裂解活力
•   4.5 本章小结
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录B：论文中使用的金黄色葡萄球菌的耐药性
• 附录C：论文中使用的商业牛奶营养成分表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王淑堃

导师: 赵伟

关键词: 噬菌体裂解酶,金黄色葡萄球菌,裂解域,结合域,牛奶杀菌

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业,轻工业手工业

单位: 江南大学

分类号: TS252.7;TS201.3

总页数: 72

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