miR-142a-5p对成骨细胞分化的调节及机制研究

论文摘要

目的:miRNA在间充质干细胞定向分化中的调控已成为当前研究热点。miR-142a-5p由miR-142基因转录后加工而来,它在胚胎发生、造血和免疫反应、肿瘤生成等许多生理过程中发挥着关键作用,但其在间充质干细胞向成脂细胞或成骨细胞分化过程中的作用机制尚不完全明确。本研究主要探讨miR-142a-5p对细胞成骨分化的影响,并对其机制进行初步探讨。方法:1、利用qRT-PCR技术检测miR-142a-5p在C57BL/6J小鼠中的组织分布情况。2、在骨髓基质细胞系ST2或前成骨细胞系MC3T3-E1细胞中通过转染miR-142a-5p agomir/antagomir以提高miR-142a-5p的水平或抑制miR-142a-5p,运用ALP染色、qRT-PCR、Western Blotting等方法检测miR-142a-5p对ST2及MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。3、构建miR-142a-5p过表达慢病毒,感染小鼠BMSCs细胞,利用ALP染色、qRT-PCR、Western Blotting等方法来进一步研究miR-142a-5p对BMSCs细胞成骨分化的影响。4、利用生物信息学软件预测miR-142a-5p的靶基因,构建靶基因荧光素酶报告基因载体,将报告质粒中miR-142a-5p预期结合位点进行定点突变,构建突变报告质粒,利用双荧光素酶报告基因技术鉴定靶基因;ST2细胞中转染miR-142a-5p agomir和miR-142a-5p antagomir后检测靶基因的蛋白表达量;miR-142a-5p agomir与靶基因过表达质粒共转染细胞进行拯救实验。5、利用顺式作用元件预测工具对miR-142a-5p的启动子区域进行分析,构建miR-142a-5p启动子报告载体,将报告载体中上游调控因子TCF7L2预测结合位点进行定点突变,构建突变的miR-142a-5p启动子报告载体,双荧光素酶报告基因技术验证上游调控因子;过表达β-catenin检测miR-142a-5p的表达水平;染色质免疫共沉淀技术探究β-catenin与miR-142a-5p启动子区是否存在物理结合。结果:1、miR-142a-5p在C57BL/6J小鼠的多种组织中分布广泛,其中,在骨中表达量最高,其次是脾、结肠、腹股沟脂肪。2、提高miR-142a-5p水平能够促进骨髓基质细胞系ST2和前成骨细胞系MC3T3-E1向成骨细胞的分化;促进与成骨分化相关的特异性基因ALP、BGLAP、Osterix、OPN、BSP的mRNA的表达,上调ALP、Runx2、Osterix的蛋白水平;抑制miR-142a-5p则会抑制ST2细胞、MC3T3-E1细胞向成骨细胞的分化。3、miR-142a-5p LV成功感染BMSCs细胞并上调miR-142a-5p的表达,促进BMSCs向成骨细胞的分化,促进与成骨分化相关的特异性基因ALP、BGLAP、BSP、Osterix的表达,上调ALP、Runx2、Osterix的蛋白水平。4、双荧光素酶报告基因技术表明miR-142a-5p agomir能使Nfia 3’UTR荧光素酶活性降低;ST2细胞中转染miR-142a-5p agomir后可下调Nfia蛋白的表达量,而转染miR-142a-5p antagomir后可上调Nfia蛋白表达量;细胞拯救实验表明,Nfia能减弱miR-142a-5p agomir对ST2细胞成骨分化的促进作用。5、过表达β-catenin可使miR-142a-5p启动子荧光素酶活性升高,而将TCF7L2预测结合位点进行定点突变后能减弱β-catenin过表达对miR-142a-5p启动子荧光素酶活性的促进作用;ST2细胞转染β-catenin,检测miR-142a-5p表达明显上调;DKK1处理ST2细胞后miR-142a-5p表达水平明显下调;染色质免疫共沉淀结果表明β-catenin与miR-142a-5p启动子存在物理结合。结论:1、miR-142a-5p在小鼠骨组织高表达,提示miR-142a-5p可能与成骨细胞的分化相关。2、miR-142a-5p可以促进BMSCs、ST2、MC3T3-E1细胞的成骨分化。3、miR-142a-5p可能通过靶向抑制Nfia的表达来促进成骨细胞分化。4、β-catenin可与miR-142a-5p启动子结合,调控前体细胞中miR-142a-5p的表达变化。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词
• 前言
•   研究现状、成果
•   研究目的、方法
• 一、miR-142a-5p对成骨细胞分化的影响
•   1.1 对象和方法
•     1.1.1 实验材料
•     1.1.2 实验方法
•     1.1.3 统计学方法
•   1.2 结果
•     1.2.1 miR-142a-5p在 C57BL/6J小鼠中的组织分布
•     1.2.2 miR-142a-5p agomir对 ST2 细胞成骨分化的影响
•     1.2.3 miR-142a-5p agomir对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响
•     1.2.4 miR-142a-5p antagomir对 ST2 细胞成骨分化的影响
•     1.2.5 miR-142a-5p antagomir对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响
•     1.2.6 miR-142a-5p LV慢病毒对MSCs细胞成骨分化的影响
•   1.3 讨论
•   1.4 小结
• 二、miR-142a-5p对成骨细胞分化的机制研究
•   2.1 对象和方法
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 实验方法
•     2.1.3 统计学方法
•   2.2 结果
•     2.2.1 miR-142a-5p调控成骨细胞分化的分子机制的初步探讨
•     2.2.2 miR-142a-5p的上游调控机制
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 miRNA对间充质干细胞成骨分化的调控及其在骨再生中的应用
•   综述参考文献
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 冯雪

导师: 李晓霞

关键词: 微小,骨髓间充质干细胞,成骨细胞分化,骨质疏松

来源: 天津医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 天津医科大学

基金: 国家自然科学基金青年基金(81601864)

分类号: R329.2

DOI: 10.27366/d.cnki.gtyku.2019.000273

总页数: 96

文件大小: 1666K

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