粘质沙雷氏菌外膜磷脂酶A（A1）基因克隆、异源表达及其在菜籽油中脱胶研究

论文摘要

化学精炼植物油的目的是为了除去会对成品油的质量和保质期造成不良影响的杂质。然而,考虑到对环境的影响和经济效益,物理精炼方法的使用正在增加。酶促脱胶则是一种能够达到物理精炼油要求的脱胶方法,但磷脂酶的生产高成本和低效率局限了其应用。同时,用于脱胶的磷脂酶不能被回收和再次利用也大大提高了酶法脱胶的工业化应用成本。本研究克隆外膜磷脂酶A1基因,构建原核和真核表达载体,实现其在原核和真核表达体系中的异源表达,研究了其酶学特性与固定化过程,并将其应用于粗菜籽油的酶法脱胶中,为开发新型磷脂酶和改进脱胶技术提出了一种有效可行的方法,主要结果如下:（1）外膜磷脂酶A1基因克隆及生物信息学分析。将粘质沙雷氏菌总基因组当模板,PCR扩增得到目的基因,构建pEASY-OM-PLA1,转入E.coil DH5α,抽取质粒测序验证并分析。该基因与Serratia marcescens subsp.marcescens Db11同源性为99.55%。进化树结果显示,该基因所产OM-PLA1与来源于大肠杆菌NC000913.3的OM-PLA1表现出最高的同源性。该蛋白分子式为C1513H2249N411O449S6,相对分子质量为33572.34,是稳定亲水性蛋白,含有信号肽,为胞外分泌蛋白,蛋白二级结构中α-螺旋占15.75%,β-折叠占36.64%,无规则卷曲占47.60%且不含有非常规二级结构,三级结构显示每个单体为β-桶状结构。（2）重组大肠杆菌构建、酶学特性及酶法脱胶。将pEASY-OM-PLA1转入E.coil BL21（DE3）中,外膜磷脂酶A1的活性在诱导4 h和IPTG浓度0.6 mmol/L的条件下最大化。重组蛋白经Ni2+柱纯化后SDS-PAGE检测显示,有一分子量约为33 KDa的特异性条带。酶学性质研究结果显示,其最适pH和最适温度分别为7.5和50℃,在pH 7.0-8.0和45-55℃内其稳定性较好,酶动力学参数为Km=31.954mM,Vmax=1.5056 mM/min,0.1 mmol/L的Ca2+、Mg2+、Co2+、Mn2+溶液能显著提高其酶活力,1 mmol/L的Cu2+、Zn2+、SDS、EDTA、EGTA溶液则显著抑制了其酶活力。用于粗菜籽油脱胶,当酶添加量为15 U和脱胶时间为2 h时,脱胶油样中的磷含量值均从22.6 mg/kg降低至10 mg/kg以下。（3）重组毕赤酵母构建及诱导表达。基因上下游嵌入酶切位点后,通过双酶切及T4连接酶过夜连接的方法,构建出pPIC9K-His-OM-PLA1,将其导入毕赤酵母GS115中。结果显示,重组毕赤酵母为His+Muts表型即甲醇缓慢利用型,基因组DNA经凝胶电泳检测显示具有大小约为900bp的单一条带。在诱导72 h后,酶活到达最大为3.21 U/mL,目的蛋白经Ni2+柱纯化和超滤管浓缩后,SDS显示特定的蛋白质条带,其分子量约为33 KDa,且酶活最大达到21.2 U/mL。分别在初始转接量为50 mL、温度为28℃和甲醇浓度为1%时,重组毕赤酵母分泌表达的OM-PLA1酶活较高。（4）外膜磷脂酶A1的固定化及酶法脱胶。采取水热共沉淀法制备了载体Fe3O4/氧化石墨烯,成功制备出载体材料后通过加入戊二醛将重组毕赤酵母分泌表达的外膜磷脂酶A1固定在载体材料上。最佳固定化条件是缓冲液pH为6、戊二醛的浓度为7%和固定化时间为3 h。制备出来的固定化外膜磷脂酶A1最适pH为7.5、最适温度为50℃,在4℃环境下保存近3个月后还留有58.9%的原始酶活力。将其用于粗菜籽油的酶法脱胶,pH 7.5、反应时间2.5 h、反应温度50℃是最佳脱胶条件,固定化外膜磷脂酶A1循环脱胶13次后,还具有初始酶活力的51.7%。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 磷脂酶概述
•     1.1.1 磷脂酶简介
•     1.1.2 磷脂酶A1 简介
•   1.2 外膜磷脂酶A简介
•     1.2.1 外膜磷脂酶A的结构
•     1.2.2 外膜磷脂酶A的催化机制
•     1.2.3 外膜磷脂酶A的激活机制
•   1.3 微生物磷脂酶分子生物学研究
•   1.4 磷脂酶的修饰
•     1.4.1 磷脂酶的化学修饰
•     1.4.2 磷脂酶的固定化
•   1.5 本课题的研究背景、意义及主要内容
•     1.5.1 研究背景
•     1.5.2 研究意义及目的
•     1.5.3 主要内容
•     1.5.4 项目资助
•     1.5.5 主要技术路线框架图
• 第二章 外膜磷脂酶A1（OM-PLA1）基因克隆及原核表达
•   2.1 材料与仪器
•     2.1.1 质粒与菌株
•     2.1.2 试剂
•     2.1.3 主要仪器
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 溶液的配制
•     2.2.2 粘质沙雷氏菌总基因组的提取
•     2.2.3 外膜磷脂酶A1 基因的PCR扩增及回收
•     2.2.4 PCR产物的连接与转化
•     2.2.5 质粒提取及测序鉴定
•     2.2.6 外膜磷脂酶A1 基因生物学信息分析
•     2.2.7 重组质粒转化BL21
•     2.2.8 原核诱导表达重组外膜磷脂酶A1
•     2.2.9 重组外膜磷脂酶A1 酶活力测定
•     2.2.10 粗酶液纯化及SDS-PAGE鉴定
•     2.2.11 外膜磷脂酶A1 原核表达条件优化
•     2.2.12 重组外膜磷脂酶A1 的酶学特性研究
•     2.2.13 重组外膜磷脂酶A1 的菜籽油脱胶应用
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 目的基因的扩增
•     2.3.2 菌落PCR鉴定
•     2.3.3 测序鉴定
•     2.3.4 蛋白进化树的构建
•     2.3.5 生物学信息分析
•     2.3.6 重组蛋白的纯化及SDS-PAGE鉴定
•     2.3.7 重组外膜磷脂酶A1 诱导表达优化
•     2.3.8 重组外膜磷脂酶A1 酶学特性研究
•     2.3.9 酶法脱胶条件优化
•   2.4 本章小结
• 第三章 外膜磷脂酶A1（OM-PLA1）基因在毕赤酵母中的表达、固定化及菜籽油脱胶
•   3.1 材料与仪器
•     3.1.1 菌株与质粒
•     3.1.2 所用试剂
•     3.1.3 主要仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 溶液的配制
•     3.2.2 表达载体的构建
•     3.2.3 表达载体转化P.pastoris GS115
•     3.2.4 转化子表型筛选
•     3.2.5 重组毕赤酵母的鉴定
•     3.2.6 重组外膜磷脂酶A1 在毕赤酵母中的表达
•     3.2.7 重组毕赤酵母的发酵条件优化
• 3O₄/氧化石墨烯的制备及外膜磷脂酶A1 的固定化'>    3.2.8 Fe₃O₄/氧化石墨烯的制备及外膜磷脂酶A1 的固定化
•     3.2.9 固定化外膜磷脂酶A1 菜籽油脱胶应用
•     3.2.10 固定化外膜磷脂酶A1 酶法脱胶条件优化
•     3.2.11 固定化外膜磷脂酶A1 的回收和再利用
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 目的基因PCR扩增及纯化回收
•     3.3.2 表达载体pPIC9K-His-OM-PLA1 的构建
•     3.3.3 重组毕赤酵母的构建与表型筛选
•     3.3.4 重组毕赤酵母PCR鉴定
•     3.3.5 重组P.pastoris表达外膜磷脂酶A1 的酶活测定
•     3.3.6 重组外膜磷脂酶A1 的纯化及SDS-PAGE
•     3.3.7 重组毕赤酵母发酵条件优化
• 3O₄/氧化石墨烯表征分析'>    3.3.8 Fe₃O₄/氧化石墨烯表征分析
•     3.3.9 固定化外膜磷脂酶A1 固定化条件优化
•     3.3.10 pH和温度对固定化外膜磷脂酶A1 酶活力的影响
•     3.3.11 固定化外膜磷脂酶A1 贮藏稳定性研究
•     3.3.12 菜籽油脱胶条件优化
•     3.3.13 固定化外膜磷脂酶A1 的回收和利用
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 第四章 结论与展望
•   4.1 结论
•   4.2 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴芸

导师: 杨培周

关键词: 外膜磷脂酶,大肠杆菌,毕赤酵母,固定化,酶法脱胶

来源: 合肥工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业,轻工业手工业

单位: 合肥工业大学

基金: “十三五”国家重点研发计划菜籽油酶法脱胶工艺技术研究(2016YFD0401401-2)和安徽省自然科学基金(1908085MC80)

分类号: TS225.14;Q814

总页数: 98

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