猪瘟病毒E2蛋白真核表达与纯化及单克隆抗体制备

论文摘要

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是猪的一种高度传染性疾病。世界动物卫生组织规定猪瘟是动物卫生法典要求必须报告的动物疫情,在我国猪瘟亦属于动物疫病名录一类动物疫病。目前猪瘟疫苗已广泛应用到养猪行业,猪瘟防控主要的方法是酶联免疫吸附法（Elisa）,用来检测接种疫苗后的猪是否产生抗体。然而IDEXX公司垄断了竞争法Elisa试剂盒市场,国内的试剂盒的原料制备无法与之匹敌。病因学中猪瘟病毒（Classical swine fever,CSFV）是具有正义单链RNA基因组的病毒,属于黄病毒科（Flaviviridae）中瘟病毒属（Pestivirus）的成员。CSFV大小为12.5kb,基因组包含单个开放阅读框,编码a3898-氨基酸的多蛋白,最终细胞和病毒通过编码11-12个切割产物（NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4BNS5A-NS5BCOOH）,共翻译和翻译后加工表达多蛋白。CSFV病毒粒子的结构成分包括核心（C）蛋白质和糖蛋白（Erns,E1,E2）;其中E1和E2是I型N-末端具有多糖核糖核酸的跨膜蛋白,C-末端为疏水性结构域;E2是CSFV诱导中和抗体的糖蛋白中最具免疫原性的,其提供针对致死性CSFV攻击的保护。所以E2是CSF防控的重点研究靶标,生产E2蛋白以及制备E2相关抗体作为Elisa检测原料对于防控CSF具有重要的意义。本研究从NCBI数据库中获取编号为AY775178.2:2441-3559的猪瘟病毒株石门/HVRI中E2基因。将其进行生物信息学预测,切掉C端341-373疏水基团氨基酸的基因序列并装载6×His标签,N端装载蜂毒素肽为信号肽,同时对E2基因进行密码子优化并基因合成得到目的基因装载在pUC57载体上。使用BamH I/Xho I分别双酶切pUC57-E2和pFastBac1后进行连接,产物回收后转化至DH5α感受态,扩增并提取质粒后进行双酶切鉴定及测序鉴定。鉴定成功后将重组质粒转入DH10b菌株中并使用卡那霉素、庆大霉素、四环素、IPTG、X-Gal进行两轮蓝白斑筛选,挑取白斑进行菌落PCR鉴定正确后提取重组质粒。将重组的pFastBac1-E2质粒使用昆虫表达系统分泌表达E2蛋白,首先使用脂质体法转染昆虫sf9细胞后,从P1代病毒侵染P2病毒代开始至P4代表达E2蛋白,收取培养基,离心固液分离后使用切向流超滤浓缩,应用AKTA蛋白纯化系统使用Ni树脂纯化E2蛋白,咪唑浓度为200 mM将E2蛋白洗脱下来后,再使用G25脱盐后浓缩得到浓度为0.5 mg/mL,其总蛋白量为4.42 mg的E2蛋白。使用重组E2蛋白免疫Balb/c小鼠,首次60μg/只,之后每两周加强免疫一次,共免疫四次,每次30μg/只;使用已知E2抗体间接ELISA确定最优抗原包被量1μg/mL,使用棋盘滴定法进行间接法ELISA确立最优抗原包被量为1μg/mL。加强免疫第四次的一周后进行断尾采血,进行间接ELISA血清效价检测。检测免疫小鼠1#血清稀释倍数为时P/N值在3以上。选取小鼠1#进行细胞融合,融合之后进行亚克隆筛选三次,挑选阳性克隆进行腹水的制备及纯化;最后进行抗体分型、浓度及纯度检测。最终得到6株杂交瘤,其中分型鉴定克隆号2H4为重链亚型IgG1、轻链亚型为Kappa,3.5 mg/mL,7mL,抗体总质量24.5 mg,纯度约95%。为后续CSFV抗体ELISA检测试剂盒的开发、微流控技术的应用及CSFV防控奠定坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1.1 猪瘟概述
•     1.1.1 猪瘟的流行病分析
•     1.1.2 猪瘟的临床症状和致病机理
•   1.2 猪瘟病毒研究进展
•     1.2.1 猪瘟病毒基因及蛋白
•     1.2.2 猪瘟病毒E2 蛋白
•   1.3 E2 基因抗原的制备
•     1.3.1 蛋白质抗原及表达系统
•     1.3.2 全细胞抗原
•     1.3.3 基因抗原
•   1.4 蛋白质的分离纯化
•     1.4.1 蛋白质的切向流过滤技术
•     1.4.2 蛋白质的层析分离技术
•   1.5 单克隆抗体的制备方法
•     1.5.1 鼠杂交瘤法
•     1.5.2 兔杂交瘤法
•     1.5.3 兔B淋巴细胞分选法
•     1.5.4 噬菌体展示技术
•   1.6 论文研究目的及意义
• 第二章 猪瘟病毒E2蛋白重组质粒构建
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料与设备
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 主要试剂及配方
•     2.2.3 主要仪器设备
•   2.3 实验方案
•     2.3.1 序列查找与设计
•     2.3.2 重组质粒的构建
•     2.3.3 重组质粒的鉴定及提取
•   2.4 实验结果与分析
•     2.4.1 酶切结果
•     2.4.2 酶连接反应及双酶切鉴定结果
•     2.4.3 测序结果比对
•     2.4.4 重组质粒的菌落PCR鉴定
•     2.4.5 重组质粒的提取
•   2.5 结果分析
•   2.6 小结
• 第三章 猪瘟病毒E2蛋白表达与纯化
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料与设备
•     3.2.1 实验材料
•     3.2.2 实验试剂及配方
•     3.2.3 主要仪器设备
•   3.3 实验方案
•     3.3.1 转染昆虫细胞
•     3.3.2 病毒扩增与蛋白表达
•     3.3.3 E2 蛋白小量纯化
•     3.3.4 凝胶电泳检测（SDS-PAGE）
•     3.3.5 蛋白质浓度的测定
•     3.3.6 P3 代蛋白表达测试
•     3.3.7 免疫印迹检测（Western Blot）
•     3.3.8 切向流超滤浓缩重组蛋白
•     3.3.9 AKTA纯化重组蛋白
•     3.3.10 重组蛋白的脱盐
•     3.3.11 重组蛋白的超滤浓缩
•   3.4 实验结果与分析
•     3.4.1 病毒的侵染及重组蛋白的表达
•     3.4.2 E2 蛋白的小量纯化
•     3.4.3 E2 蛋白的表达测试
•     3.4.4 E2 蛋白的大量表达与纯化
•   3.5 结果分析
•   3.6 小结
• 第四章 鼠单克隆抗体的制备
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料与设备
•     4.2.1 实验材料
•     4.2.2 实验试剂及配方
•     4.2.3 主要实验设备
•   4.3 实验方案
•     4.3.1 小鼠免疫
•     4.3.2 间接酶联免疫吸附测定法（Elisa）建立
•     4.3.3 免疫小鼠效价检测
•     4.3.4 冲击免疫
•     4.3.5 细胞融合
•     4.3.6 克隆筛选
•     4.3.7 阳性克隆冻存及放大
•     4.3.8 抗体分型（Elisa法）
•     4.3.9 腹水的制备与纯化
•     4.3.10 紫外分光光度法抗体浓度测定
•     4.3.11 SDS-Page检测抗体浓度
•   4.4 实验结果与分析
•     4.4.1 酶联免疫吸附测定法（Elisa）建立
•     4.4.2 第四次免疫间接法Elisa结果
•     4.4.3 第五次免疫间接法Elisa结果
•     4.4.4 细胞融合
•     4.4.5 主克隆筛选
•     4.4.6 挑克隆筛选
•     4.4.7 第一次亚克隆Elisa筛选
•     4.4.8 第二次亚克隆Elisa筛选
•     4.4.9 抗体腹水制备及纯化
•   4.5 结果分析
•   4.6 小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈嘉琛

导师: 王毅

关键词: 猪瘟,蛋白,昆虫表达系统,鼠单克隆抗体制备

来源: 中南民族大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中南民族大学

分类号: S852.65

总页数: 86

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