拟南芥RUS4基因在花药开裂和花粉发育中的功能分析

论文摘要

DUF647（Domain of Unknown Function 647,DUF647）蛋白家族是在真核生物,包括动物、植物和一些真菌中广泛存在的一个蛋白家族。在拟南芥中,编码DUF647蛋白的基因一共有6个,分别是RUS1（At3g45890）、RUS2（At2g31190）、RUS3（At1g13770）、RUS4（At2g23470）、RUS5（At5g01510）和RUS6（At5g49820）。然而,到目前为止,只有RUS1和RUS2的功能已有研究,它们共同参与根感知UV-B信号途径,其余4个RUS基因的功能未见报道。本论文以人工microRNA（artificial microRNA,amiRNA）特异沉默RUS4的转基因拟南芥（称为amiR-rus4）为材料,对RUS4基因在花药开裂和花粉发育中的作用进行了比较祥尽的研究,取得了以下结果:1、RUS4敲减导致花药不能开裂qPCR分析发现,RUS4在amiR-rus4花蕾中的表达量显著下降,RUS4的敲减导致育性大幅降低。相互杂交实验表明,amiR-rus4株系的雌蕊正常,雄蕊的发育存在缺陷。通过扫描电镜和半薄切片技术进一步发现,amiR-rus4花药的药室内壁缺少次生加厚,使得花药不能开裂,进而影响了雄性育性。在amiR-rus4花蕾中,调控药室内壁次生加厚的两个关键基因NST1和NST2的表达均有显著的下调。此外,与纤维素合成有关的IRX1、IRX3和IRX5以及与木聚糖合成有关的IRX8的表达也都有不同程度的下调。然而,与木质素单体合成相关的IRX4在amiR-rus4和野生型花蕾中的表达量变化不大。将35Spro:RUS4转入amiR-rus4中,敲减株系的育性恢复正常。将35Spro:RUS4转入野生型中,RUS4过表达引起NST1和NST2表达量不同程度的变化。相应地,花药药室内壁和花丝的次生加厚有明显增强。但是,在RUS4过表达株系中,其它器官并没有观察到异位次生加厚。2、RUS4敲减影响花粉发育亚历山大染色发现,野生型花粉为紫色,amiR-rus4花粉却几乎全部是绿色,这意味着RUS4敲减损害了花粉活力。花粉的体外萌发实验表明,在相同条件下,野生型花粉的萌发率为72.7%,而amiR-rus4花粉的萌发率只有4.4%,野生型花粉管的平均长度为394.4μm,而amiR-rus4花粉管的平均长度为227.0μm,花粉萌发率显著下降和花粉管长度明显缩短进一步证实amiR-rus4花粉活力的降低。而体内萌发实验也确认了花粉萌发率的下降。透射电镜观察发现,绒毡层退化产生的造油体和绒毡层小体沉积到野生型花粉的表面并填充到花粉外壁的孔隙形成花粉被。但是,在amiR-rus4花粉中,这两类细胞器却并没有填充到花粉外壁的孔隙,而是堆积到了药室。DPBA和Nile Red染色显示,amiR-rus4缺少由类黄酮和脂类成分构成的花粉被,而这也是导致花粉活力降低的主要原因。3、RUS4在不同组织中均有表达,但在花药中高表达半定量PCR显示,RUS4在根、茎、叶、幼苗、花蕾和花中都有表达。RUS4pro:GUS染色进一步发现,RUS4在以上这些组织的细胞壁和维管束中表达,但在花药中高表达:在花药发育的第10阶段之前,RUS4主要在绒毡层表达;在花药发育的第11和12阶段,RUS4表达最强,遍布整个花药;在花药发育的第13和14阶段,RUS4表达减弱并主要在花粉中表达。此外,通过观察35Spro:RUS4-GFP转基因植株发现,RUS4定位在叶绿体,而且RUS4在花粉外壁和花粉被中均有表达。综上,RUS4不仅在药室内壁细胞次生壁的形成中发挥重要作用,而且还通过参与花粉外壁和花粉被的形成来影响花粉发育,从而影响拟南芥雄性育性。RUS4的表达模式进一步支持RUS4在花药和花粉发育中的功能。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 模式植物拟南芥
•   1.2 拟南芥RUS基因的研究进展
•     1.2.1 拟南芥RUS基因的发现
•     1.2.2 拟南芥RUS基因的功能
•   1.3 雄蕊发育
•     1.3.1 雄蕊特化
•     1.3.2 花药发育
•     1.3.3 花药开裂
•   1.4 花粉发育
•     1.4.1 小孢子发生
•     1.4.2 雄配子发生
•   1.5 花粉粒中主要的脂类结构与功能
•     1.5.1 孢粉素
•     1.5.2 花粉被
•     1.5.3 花粉细胞内油体
•     1.5.4 内膜系统
•   1.6 本研究的背景及意义
• 第二章 RUS4敲减导致花药不能开裂
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 菌株和质粒
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 主要仪器
•     2.1.5 常用溶液和培养基配方
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 拟南芥的种植
•     2.2.2 花药整体透明
•     2.2.3 花药的溴化乙锭和吖啶橙染色
•     2.2.4 扫描电镜
•     2.2.5 半薄切片
•     2.2.6 总RNA提取
•     2.2.7 反转录
•     2.2.8 荧光定量PCR
•     2.2.9 半定量PCR
• pro:RUS4过表达载体的构建及转化拟南芥'>    2.2.10 35S_pro:RUS4过表达载体的构建及转化拟南芥
•     2.2.11 转基因植株的筛选和鉴定
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 表型分析
•     2.3.2 amiR-rus4雄蕊发育存在异常
•     2.3.3 amiR-rus4花药不能正常开裂
•     2.3.4 amiR-rus4花药的药室内壁缺少次生加厚
•     2.3.5 与药室内壁次生加厚相关基因在amiR-rus4花蕾中的表达降低
•     2.3.6 RUS4过表达可以互补amiR-rus4株系表型
•     2.3.7 RUS4过表达引起NST1和NST2不同程度的变化
•     2.3.8 RUS4过表达特异性地引起雄蕊次生加厚增强,但不会诱发其它组织的异位次生加厚
•   2.4 讨论
• 第三章 RUS4敲减影响花粉发育
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要仪器
•     3.1.4 常用溶液和培养基配方
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 亚历山大染色
•     3.2.2 花粉体外萌发
•     3.2.3 苯胺蓝染色
•     3.2.4 花粉的DPBA和 Nile Red染色
•     3.2.5 扫描电镜
•     3.2.6 透射电镜
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 amiR-rus4花粉活力下降
•     3.3.2 amiR-rus4 花粉萌发率降低,花粉管长度变短
•     3.3.3 amiR-rus4花粉严重变形
•     3.3.4 amiR-rus4花粉被的形成遭到破坏
•   3.4 讨论
• 第四章 RUS4表达模式
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 植物材料
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器
•     4.1.4 分离原生质体所用到的溶液
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 拟南芥的种植
•     4.2.2 RNA提取及反转录
• pro:GUS表达载体的构建及转化拟南芥'>    4.2.3 RUS4_pro:GUS表达载体的构建及转化拟南芥
• pro:RUS4-GFP过表达载体的构建及转化拟南芥'>    4.2.4 35S_pro:RUS4-GFP过表达载体的构建及转化拟南芥
•     4.2.5 转基因植株的筛选和鉴定
•     4.2.6 GUS染色
•     4.2.7 原生质体的分离
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 RUS4在不同组织中均有表达
•     4.3.2 RUS4在花药中高表达
•     4.3.3 RUS4在花粉外壁和花粉被中表达
•     4.3.4 RUS4定位在叶绿体
•   4.4 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简介及联系方式

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李文超

导师: 赵淑清

关键词: 拟南芥,花药开裂,花粉发育

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 山西大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.001523

总页数: 93

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