茎瘤固氮根瘤菌ORS571二鸟苷酸环化酶基因功能的研究

论文摘要

茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）菌株ORS571可与宿主植物毛萼田菁（Sesbania rostrata）共生形成根瘤或茎瘤而共生固氮,也可在自生状态下固氮生存。环二鸟苷酸（cyclic diguanylate or cyclic di-guanosine monophosphate,c-di-GMP）作为细菌中普遍存在的第二信使,在细胞信号转导中起到十分重要的作用。c-di-GMP能够调节各种生理功能的前提是二鸟苷酸环化酶（diguanylate cyclase,DGC）和磷酸二酯酶（phosphodiesterase,PDE）能接受到来自感应结构域如PAS、GAF、REC等的信号的传递,从而启动或关闭相关基因的转录和翻译,调节细胞内c-di-GMP水平的变化。本文应用生物信息学工具分析编码二鸟苷酸环化酶（DGC）的基因,从中选择5个含有不同感应结构域的环化酶基因（包括AZC-2411、AZC-2412、AZC-2512、AZC-3566和AZC-3914）进行深入研究,以期解析c-di-GMP在A.caulinodans strain ORS571中的调控作用,主要研究内容和结果如下:（1）生物信息学分析显示,5个候选DGC蛋白都具有GGDEF结构域,推测5个候选DGC蛋白可能具有催化生成c-di-GMP的二鸟苷酸环化酶活性。采用基于cre-loxp重组酶系统的根瘤菌基因敲除体系和采用三亲接合技术,成功地构建了这5个候选DGC蛋白各自的基因敲除突变株,即ΔAZC-2411、ΔAZC-2412、ΔAZC-2512、ΔAZC-3566和ΔAZC-3914。（2）为阐明所选基因的功能,本文对上述突变株的表型进行鉴定。在液体培养基中测试生长状况,绘制各突变株的生长曲线。利用液相色谱串联质谱法测定各突变株体内c-di-GMP含量。在L3半固体平板上检测趋化能力,观察各突变株趋化圈的大小。在有氧条件下进行絮凝实验,测定各突变株的絮凝量。利用结晶紫染色法测定生物膜,观察各突变株的生物膜产量变化。利用蒽酮-浓硫酸氧化法测定胞外多糖产量,检测各突变株胞外多糖生产水平。通过进行竞争性结瘤实验,探究各突变株与宿主植物互作能力。实验结果表明,5个突变株的生长与野生型几乎无差异。与野生型相比,除3株突变体（AZC-2411,AZC-3566和AZC-3914）无显著差异外,突变株ΔAZC-2412和ΔAZC-2512的c-di-GMP含量、絮凝量和胞外多糖产量均减低,然而趋化能力增强。此外,无论是在L3-N或L3+N培养基中,突变株ΔAZC-2412和ΔAZC-2512形成的生物膜量均低于野生型。竞争结瘤实验显示,突变株ΔAZC-2412和ΔAZC-2512的结瘤能力亦显著降低。研究表明环二鸟苷酸合成酶基因AZC-2412和AZC-2512均能通过控制c-di-GMP水平,进而调控A.caulinodans菌株ORS571的生理生化（胞外多糖、细菌运动、生物膜和细胞絮凝）及与宿主植物互作（结瘤固氮）等生物学特性。这些发现为全面解析细菌第二信使c-di-GMP介导的调控机制提供了新知识,也为优异固氮菌株A.caulinodans ORS571的应用提供了科学参考。

论文目录

• 摘要
• 第一章 绪论
•   1.1 茎瘤固氮根瘤菌的相关介绍
•   1.2 细菌环二鸟苷酸的研究进展
•     1.2.1 环二鸟苷酸（c-di-GMP）
•     1.2.2 c-di-GMP的合成和降解
•     1.2.3 GGDEF和EAL结构域蛋白的作用
•     1.2.4 c-di-GMP的功能
•       1.2.4.1 c-di-GMP对生物膜形成的调控
•       1.2.4.2 c-di-GMP对胞外多糖生产的调控
•       1.2.4.3 c-di-GMP对细胞运动的调控
•       1.2.4.4 c-di-GMP调控细菌的毒力
•   1.3 基因敲除的研究
•     1.3.1 基因敲除概念
•     1.3.2 基因敲除研究进展
•     1.3.3 基因敲除方法
•       1.3.3.1 传统的基因敲除技术
•       1.3.3.2 新式的基因敲除技术
•     1.3.4 基因敲除应用
•   1.4 本研究的目的及意义
•   1.5 技术路线
• 第二章 相关基因的生物信息学分析及突变株构建
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 供试质粒和菌株
•     2.1.2 主要仪器及试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 序列分析方法
•       2.2.1.1 结构域分析
•       2.2.1.2 序列比对分析
•       2.2.1.3 二级结构分析
•       2.2.1.4 跨膜结构分析
•       2.2.1.5 疏水性分析
•     2.2.2 突变株构建方法
•       2.2.2.1 茎瘤固氮根瘤菌ORS571基因组DNA的提取
•       2.2.2.2 PCR引物设计
•       2.2.2.3 PCR扩增反应
•       2.2.2.4 PCR产物与pEASY载体连接
•       2.2.2.5 连接产物转化及蓝白斑筛选
•       2.2.2.6 质粒提取
•       2.2.2.7 酶切
•       2.2.2.8 酶切产物胶回收
•       2.2.2.9 目的基因上下游片段与敲除载体p CM351连接转化
•       2.2.2.10 缺失突变株构建
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 生物信息学分析结果
•       2.3.1.1 结构域分析结果
•       2.3.1.2 序列比对结果
•       2.3.1.3 二级结构分析结果
•       2.3.1.4 跨膜结构及疏水性分析结果
•     2.3.2 目的基因突变株构建结果
•   2.4 讨论与结论
• 第三章 突变株表型研究
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 供试菌株
•     3.1.2 实验引物设计
•     3.1.3 主要仪器及试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 生长曲线测定
•     3.2.2 c-di-GMP水平测定
•     3.2.3 趋化实验
•     3.2.4 絮凝实验
•     3.2.5 生物膜实验
•     3.2.6 胞外多糖实验
•     3.2.7 竞争性结瘤实验
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 生长曲线测定结果
•     3.3.2 c-di-GMP水平测定结果
•     3.3.3 趋化能力测定结果
•     3.3.4 絮凝实验结果
•     3.3.5 生物膜实验结果
•     3.3.6 胞外多糖实验结果
•     3.3.7 竞争性结瘤实验结果
•   3.4 讨论与结论
• 第四章 全文总结
• 参考文献
• Abstract
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨学智

导师: 李润植,解志红

关键词: 茎瘤固氮根瘤菌,二鸟苷酸环化酶,环二鸟苷酸,胞外多糖,生物膜,趋化性,竞争结瘤

来源: 山西农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 山西农业大学

基金: 国家农业部“948”项目(#2014-Z39),国家自然科学基金(#31570063),国家自然科学基金(#31870020),山西省煤基重点科技攻关项目(#FT-2014-01),山西省重点研发计划重点项目(#201603D312005),中科院百人计划,山东省重点研发计划(#2017GSF17129),边际土地产能效益扩增机理与藏粮于地技术模式(KFZD-SW-112),山东省农业科学院农业科技创新工程(+CXGC2016B10)

分类号: Q943.2

DOI: 10.27285/d.cnki.gsxnu.2019.000434

总页数: 55

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