日本七鳃鳗nucleolin-like基因的克隆及其在先天性免疫中的功能初探

论文摘要

七鳃鳗是迄今为止在海洋生物中发现的最原始的无颌类脊椎动物之一。其化石距今约3.6亿年,因此七鳃鳗被称为“活化石”。由于其在进化地位上的特殊性,长久以来,七鳃鳗都具有很大的研究价值。Nucleolin是真核细胞核仁中一种重要的蛋白质,具有多种重要的细胞功能,在细胞增殖、死亡、免疫,尤其在rRNA合成和免疫中扮演重要的角色。本论文首次在日本七鳃鳗（Lampetra japonica）中发现了nucleolin（核仁素,C23）的同源物（nucleolin-like）,对其进行了研究,初步取得了如下研究成果。首先,本论文成功从日本七鳃鳗的白细胞cDNA文库中克隆出长度为1941bp,编码为646个氨基酸的nucleolin-like全长基因。经过同源序列比对发现,该基因和其他脊椎动物nucleolin具有约50%的同源性。同时,构建了不同物种nucleolin的进化树,发现nucleolin-like的进化位置介于无脊椎动物和鱼类之间,与七鳃鳗在物种进化中的位置一致。其次,将nucleolin-like C端片段进行克隆并构建到pET-28a载体中,获得原核表达重组质粒。在E.coli BL21中表达原核蛋白,并纯化。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔,制备得到anti-nucleolin-like多克隆抗体,并验证了抗体的效价和特异性。通过real-time PCR、western blot和流式细胞术分析手段对nucleolin-like在日本七鳃鳗体内组织分布以及表达情况进行检测。结果表明,nucleolin-like在日本七鳃鳗白细胞和所有组织的mRNA水平均有表达,而在白细胞、鳃、肾和髓组织中的表达量更为明显。最后,以Poly（I:C）刺激日本七鳃鳗白细胞,白细胞中nucleolin-like的mRNA水平和蛋白表达水平在Poly（I:C）的刺激下均有提高。同时发现,Poly（I:C）的刺激能够使nucleolin-like由细胞核转移到细胞质中。以上结果表明,nucleolin-like在七鳃鳗的先天性免疫应答中可能扮演着与人源nucleolin相似的重要角色。综上所述,本论文首次在日本七鳃鳗中发现并克隆得到了nucleolin-like的全长基因;成功制备了anti-nucleolin-like的多克隆抗体;探明了其在日本七鳃鳗各组织中的分布;对Poly（I:C）刺激后nucleolin-like在细胞中的表达与转位情况进行了初探。为进一步研究nucleolin-like在七鳃鳗先天性免疫中的作用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文对照缩略表
• 绪论
•   1.1 Nucleolin的概述
•     1.1.1 Nucleolin的发现及结构
•     1.1.2 Nucleolin在核仁中的作用
•     1.1.3 Nucleolin的细胞内定位以及转位
•     1.1.4 Nucleolin与先天性免疫
•     1.1.5 Nucleolin与细胞凋亡
•     1.1.6 Nucleolin与人类疾病
•   1.2 七鳃鳗是研究脊椎动物进化的模式生物
•   1.3 本文的研究意义
• 第2章 日本七鳃鳗nucleolin-like的基因克隆以及生物信息学分析-8 -
•   2.1 材料
•     2.1.1 实验动物
•     2.1.2 主要药品及试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•     2.1.4 分析软件
•   2.2 方法
•     2.2.1 提取七鳃鳗的白细胞总RNA
•     2.2.2 白细胞c DNA模板的制备
•     2.2.3 Nucleolin-like基因EST序列的扩增
•     2.2.4 Nucleolin-like基因EST序列与T载体连接与转化
•     2.2.5 重组质粒的PCR鉴定
•     2.2.6 重组质粒的提取与测序
•     2.2.7 Nucleolin-like基因全长目的片段的扩增
•     2.2.8 Nucleolin-like-T重组质粒的构建
•     2.2.9 日本七鳃鳗nucleolin-like基因的生物信息学分析
•   2.3 结果
•     2.3.1 提取日本七鳃鳗的白细胞总RNA
•     2.3.2 日本七鳃鳗nucleolin-like基因EST序列的扩增
•     2.3.3 获取日本七鳃鳗nucleolin-like基因的全长序列
•     2.3.4 日本七鳃鳗nucleolin-like基因的生物信息学分析
•   2.4 讨论
• 第3章 日本七鳃鳗nucleolin-like的原核表达、蛋白纯化
•   3.1 材料
•     3.1.1 主要药品及试剂
•     3.1.2 主要仪器设备
•   3.2 方法
•     3.2.1 设计引物
•     3.2.2 PCR扩增
•     3.2.3 目的片段和pET-28a原核表达载体双酶切
•     3.2.4 Nucleolin-like-C-pET-28a重组质粒的获取
•     3.2.5 Nucleolin-like-C重组蛋白的小量诱导表达、纯化及其鉴定
•     3.2.6 Nucleolin-like-C重组蛋白的纯化
•   3.3 结果
•     3.3.1 Nucleolin-like-C-pET-28a重组质粒构建及测序
•     3.3.2 重组蛋白的表达及纯化
•   3.4 讨论
• 第4章 兔抗日本七鳃鳗nucleolin-like基因多克隆抗体的制备及鉴定
•   4.1 材料
•     4.1.1 实验动物
•     4.1.2 主要药品及试剂
•     4.1.3 主要仪器设备
•   4.2 方法
•     4.2.1 Anti-nucleolin-like多克隆抗体制备
•     4.2.2 Western Blot检测anti-nucleolin-like多克隆抗体特异性
•     4.2.3 流式细胞术检测nucleolin-like在白细胞中的表达情况
•   4.3 结果
•     4.3.1 日本七鳃鳗anti-nucleolin-like多克隆抗体的检测
•     4.3.2 Western blot实验检测anti-nucleolin-like多克隆抗体特异性
•     4.3.3 流式细胞术检测nucleolin-like在白细胞中的表达
•   4.4 讨论
• 第5章 Nucleolin-like基因在日本七鳃鳗的组织分布及其在细胞免疫中的作用
•   5.1 材料
•     5.1.1 实验动物
•     5.1.2 主要药品及试剂
•     5.1.3 主要仪器设备
•   5.2 方法
•     5.2.1 日本七鳃鳗各组织总RNA的提取
•     5.2.2 日本七鳃鳗各组织real-time PCR c DNA模板的制备
•     5.2.3 Real-time PCR检测nucleolin-like mRNA的转录水平
•     5.2.4 Western blot检测日本七鳃鳗各组织nucleolin-like的蛋白表达水平
•     5.2.5 Poly（I:C）刺激对nucleolin-like蛋白表达的影响
•   5.3 结果
•     5.3.1 Real-time PCR实验检测日本七鳃鳗各组织中nucleolin-like的 mRNA转录水平
•     5.3.2 Western Blot法检测日本七鳃鳗组织中nucleolin-like的蛋白表达
•     5.3.3 Poly（I:C）刺激对nucleolin-like蛋白表达水平的影响
•   5.4 讨论
• 结论
• 本论文的创新点
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 赵欢

导师: 李庆伟,徐扬

关键词: 七鳃鳗,先天性免疫

来源: 辽宁师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 辽宁师范大学

基金: 国家自然科学基金项目,日本七鳃鳗PKC-δ-like在细胞凋亡中的作用及分子机制的研究,(项目编号:31501911)

分类号: Q78;Q95

总页数: 77

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