差速离心、密度梯度离心、超滤离心技术在骨髓间充质干细胞外泌体提取中的应用对比观察

论文摘要

目的观察差速离心、密度梯度离心、超滤离心技术在骨髓间充质干细胞(BMSCs)外泌体提取中的应用,筛选外泌体最佳离心提取方法。方法取BMSCs培养48 h后收集细胞上清,平均分成A、B、C组,分别使用差速离心技术、密度梯度离心技术、超滤离心技术提取外泌体;记录各组外泌体提取时间;采用负染色技术观察各组外泌体形态;使用纳米颗粒跟踪分析仪测算各组外泌体浓度及大小;采用BCA法测定外泌体总蛋白浓度;采用Western blotting法检测各组外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、Alix。将肺微血管内皮细胞(PMVECs)分成5组,EC组上室加入PMVECs及培养基; LPS组上室加入PMVECs及含LPS的培养基(构建内皮细胞损伤模型); A、B、C组上室加入方法同LPS组,下室分别加入A、B、C组外泌体;采用葡聚糖渗漏实验检测外泌体内皮细胞通透性(观察外泌体对内皮细胞的修复作用),以内皮细胞通透指数表示。结果 A、B、C组的外泌体的提取时间分别为(180±8)、(203±10)、(40±5) min,A、B组外泌体的提取时间与C组相比,P均<0. 05。各组外泌体均为大小不等的椭圆形或圆形的膜性结构,边界清晰,但仅A组外泌体可见到典型的杯状结构。A、B、C组的外泌体浓度分别为(4. 46±0. 38)×108/m L、(5. 11±0. 16)×108/m L、(2. 18±0. 17)×108/m L,A、B组与C组外泌体浓度相比,P均<0. 05。A、B、C组的外泌体大小均为20～100 nm。A、B组外泌体总蛋白浓度及CD63、Alix的相对表达量均显著高于C组(P均<0. 05)。A、B、C、LPS、EC组的内皮细胞通透指数分别为2. 17±0. 15、1. 77±0. 32、2. 37±0. 42、2. 93±0. 15、1. 00±0. 00,A、B、C、LPS组的内皮细胞通透指数与EC组相比,P均<0. 05; A、B组的内皮细胞通透指数与LPS组相比,P均<0. 05。结论密度梯度离心技术虽耗时较长,但提取的外泌体纯度、浓度较高,对内皮细胞的修复作用较强,可以作为科研和临床研究的首选外泌体离心提取方法。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 细胞、试剂及仪器
•   1.2 细胞培养、分组及外泌体的提取
•   1.3 A、B、C组外泌体形态观察
•   1.5 A、B、C组外泌体总蛋白及表面标志蛋白CD9、CD63、Alix的检测
•   1.6 外泌体内皮细胞通透性检测
•   1.7 统计学方法
• 2 结果
•   2.1 A、B、C组外泌体提取时间比较
•   2.2 A、B、C组外泌体形态比较
•   2.3 A、B、C组外泌体浓度及大小比较
•   2.4 A、B、C组外泌体总蛋白浓度及表面标志蛋白CD9、CD63、Alix的表达比较
•   2.5 A、B、C、LPS、EC组内皮细胞通透指数比较
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 罗靖莹,贺宏丽,郭阳,黄玮玮,黄晓波

关键词: 外泌体,外泌体提取方法,差速离心技术,密度梯度离心技术,超滤离心技术,间充质干细胞,骨髓间充质干细胞,肺微血管内皮细胞

来源: 山东医药 2019年12期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学,基础医学

单位: 电子科技大学附属医院/四川省人民医院

基金: 四川省医学科学院·四川省人民医院青年博士基金(2015BS07)

分类号: R329.2

页码: 48-52

总页数: 5

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