灰黄霉素产生菌D-756的等离子体诱变及其基因组研究

论文摘要

灰黄霉素是一种抗真菌抗生素,临床上被用于治疗皮肤癣菌感染,也可以用作防治农作物真菌病害。本研究的研究对象灰黄青霉D-756是我院吴松刚等自野生菌灰黄青霉4541经多代复合诱变获得的灰黄霉素高产突变株,具有很强的利用淀粉类原料能力及耐氯特性,是早期的生产菌株。为了更好地了解生产菌株的细胞运作过程和代谢机制,为进一步改良工业菌株提供指导,我们以突变株D-756为研究菌株,对其进行全基因组测序,了解其灰黄霉素生物合成基因簇和关键调控因子;同时对D-756进行了等离子体诱变选育,期望进一步筛选优良突变株。研究内容如下:1.灰黄青霉D-756的ARTP诱变:采用ARTP（atmospheric and room temperature plasma）诱变仪对D-756菌株进行诱变,大米孢法初筛,重氮盐法测量灰黄霉素的效价。初筛结果表明ARTP诱变的正突变率为19.5%,最佳诱变时间为150s。摇瓶复筛结果显示,突变株3-41的灰黄霉素效价最高,比出发株D-756提高了23%。2.灰黄青霉D-756及野生菌株的发酵产物灰黄霉素的LC/MS（liquid chromatograph-mass spectrometer）分析:采用液质联用（LC/MS）技术对D-756及两株野生菌株的发酵产物进行检测,并考察培养基中氯离子对灰黄霉素合成的影响。比较了D-756与野生菌株4541和40293的发酵产物灰黄霉素的LC/MS图谱,结果显示D-756的灰黄霉素对应的紫外吸收峰面积是两个野生菌的近170倍,该结果与重氮盐法测定的效价结果高度一致;含氯培养基和去氯培养基的D-756发酵产物中灰黄霉素与脱氯灰黄霉素的紫外吸收峰面积比分别为16:1和1:3,说明氯离子对灰黄霉素合成的重要性。3.克隆了突变株D-756与野生菌4541,40293的ITS和18S rDNA序列并进行测序。结果表明D-756,40293,4541三株菌的ITS片段均为545bp,且序列完全一致;三株菌的18S rDNA片段长均为1715bp,其序列相似性均大于99%。将三株菌的ITS和18S rDNA序列在GenBank数据库中进行同源性检索,并构建NJ系统发育树。系统发育分析表明这3株菌高度同源,且与灰黄青霉Penicillium griseofulvum（GU566212.1,NR103892.1,AY373917.1等）聚成一簇。4.灰黄青霉D-756的全基因组测序:采用illuminaHiSeq PE150和PacBio SMRT测序平台进行D-756的全基因组测序。结果表明灰黄青霉D-756基因组由6个scaffolds组成,基因组大小为28.9Mb,GC含量为47.4%,基因6513个,tRNA 188个,rRNA 47个,sRNA 3个,snRNA 44个,各类重复序列8046个。各类基因功能分析显示,灰黄青霉D-756的基因组有众多基因参与运输和分解代谢、信号传导及碳水化合物、氨基酸代谢,提示D-756菌株利用碳、氮源能力及物质交换能力强,具备生产菌株的性能;CAZy功能分析表明,在注释的碳水化合物活性酶中超过60%的酶属于糖苷水解酶类,这很好地解释了D-756发酵生产中强大的利用淀粉类原料的表型。利用已公布的灰黄霉素基因簇的序列比较分析了D-756基因组上该基因簇的组成与排布,发现D-756灰黄霉素基因簇由12个基因组成,其中10个基因在一个簇上,另两个基因在其他scaffold上。该基因簇对D-756合成灰黄霉素的调控机制有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 绪论
•   1.灰黄霉素概述
•     1.2 灰黄霉素的理化性质
•     1.3 灰黄霉素药理作用机理
•     1.4 灰黄霉素的化学合成
•   2.微生物育种技术简介
•     2.1 传统育种手段
•     2.2 等离子体诱变育种
•   3.灰黄霉素高产菌株的选育
•     3.2 灰黄霉素的测量方法
•   4.青霉属真菌的组学研究
•   5.灰黄霉素的应用
•   6.本课题研究的目的及意义
• 第一章 灰黄青霉D-756 的等离子体诱变
•   前言
•   1.材料
•     1.1 菌株
•     1.2 培养基
•     1.3 主要药品
•     1.4 主要试剂配制
•     1.5 主要仪器
•   2.实验方法
•     2.1 菌株活化
•     2.2 ARTP诱变方法
•     2.3 初筛
•     2.4 复筛
•     2.5 灰黄霉素效价测定
•     2.6 .其他生物参数测定
•   3.结果与讨论
•     3.1 灰黄霉素标准曲线
•     3.2 ARTP诱变初筛
•     3.3 复筛菌株的摇瓶发酵
•     3.4 灰黄霉素LC/MS分析结果
•   4.小结
• 第二章 D-756的ITS和18SrDNA分析
•   前言
•   1.材料
•     1.1 菌株
•     1.2 .培养基
•     1.3 主要试剂、药品及其配制
•     1.4 主要仪器设备
•     1.5 .引物设计
•   2.实验方法
•   3.结果分析
•     3.2 基因组DNA的获得
•     3.3 18SrDNA和 ITS基因扩增结果
•     3.4 菌落PCR验证结果
•     3.5 D-756,4541及40293 菌株18SrDNA基因序列比对结果分析
•     3.6 18SrDNA基因序列构建系统发育树
•     3.7 D-756,4541 菌株及40293 菌株ITS基因序列比对结果
•     3.8 ITS基因构建系统发育树
•   4.小结
• 第三章 灰黄青霉D-756 基因组测序及分析
•   前言
•   1.材料
•     1.1 菌株
•     1.2 培养基
•     1.3 主要药品试剂及其配制
•     1.4 主要仪器
•   2.实验方法
•     2.1 测序基因组DNA提取
•     2.2 基因组DNA浓度与纯度测定
•     2.3 基因组DNA的测序
•     2.4 测序序列的生物信息学分析
•   3.结果分析与讨论
•     3.1 基因组DNA样品检测
•     3.2 基因组测序数据统计
•     3.3 基因组概况
•     3.4 基因组组分分析
•     3.5 基因功能注释
•     3.6 D-756 菌灰黄霉素基因簇的研究
•   4.小结
• 第四章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 畅瑛

导师: 施碧红

关键词: 灰黄青霉,基因组测序

来源: 福建师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 福建师范大学

分类号: Q933

DOI: 10.27019/d.cnki.gfjsu.2019.000544

总页数: 82

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